ELISPOT技術(shù)原理 
在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答（B細(xì)胞免疫），細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(cell mediated immune response，CMI)也是人們所關(guān)注的，而T細(xì)胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ ELISPOT ）。作為一項新型的免疫酶技術(shù)——酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細(xì)胞水平檢測分泌抗體細(xì)胞(ASC) 或分泌細(xì)胞因子(CK) 細(xì)胞的一項細(xì)胞免疫學(xué)檢測技術(shù)。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌CK細(xì)胞檢測或ASC測定中，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。  
       ELISPOT 法源自 ELISA，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：  
       （1） ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。  
       （2） ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量，還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）  
       由于是單細(xì)胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。  
       下面將從發(fā)展、原理、具體實驗操作、技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用幾方面進行介紹。 
ELISPOT技術(shù)的發(fā)展 
（1） ELISPOT技術(shù)的過去 
       ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人率先在1983年，運用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時起世界各國免疫學(xué)者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競賽，每個團隊都希望能率先將此一技術(shù)推廣來研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實驗的環(huán)境，藉由偵測T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子，來定量機體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應(yīng)。 
　　ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡單，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題，使當(dāng)時多數(shù)研究團隊很難獲得清晰的斑點，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實驗的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實驗，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點。  
　　第二個技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設(shè)缺乏科學(xué)實證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問題，諸如： 
    實驗所得的斑點是抗原特定T細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級效應(yīng)？  
    斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？  
    能否相信斑點是由單一的細(xì)胞造成？ 
    ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測量的頻率范圍？ 
    如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時產(chǎn)生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？  
（2） ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在 
　　1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特定T細(xì)胞的體外檢測技術(shù)。藉由檢驗新鮮分離PBMC細(xì)胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)：抗原特定T細(xì)胞的clone族群大��；和免疫效應(yīng)細(xì)胞的信號傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。 
　　多年來經(jīng)過數(shù)十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個問題，也有了科學(xué)上的驗證。目前一般公認(rèn)，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細(xì)胞水平上識別抗原特定T細(xì)胞，主要針對經(jīng)由CD4或者CD8細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶嶒炘O(shè)計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數(shù)量分析顯示斑點是由一個單細(xì)胞所生成，同時斑點形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細(xì)胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細(xì)胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細(xì)胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細(xì)胞族群變小，或減少每Precursor T細(xì)胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。 
　　ELISPOT分析技術(shù)的幾個特點已經(jīng)讓它在抗原特定T細(xì)胞免疫學(xué)上獨占鰲頭。此技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強效的解析力使流式細(xì)胞技術(shù)也望其項背，以目前國內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細(xì)胞免疫學(xué)研究是必須的，因為抗原特定T細(xì)胞一般在機體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男�價，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構(gòu)，病人血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標(biāo)準(zhǔn)對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利ELISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。 
（3） ELISPOT 未來展望 
　　ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細(xì)胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進入一個器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識。 
　　從各國文獻可見ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內(nèi)的一個特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時也在數(shù)個疫苗效價評估人體試驗中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來監(jiān)測HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計劃將是首次利用ELISPOT技術(shù)對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關(guān)研究。我們期待未來此技術(shù)能在我國免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。  

原理 
       ELISPOT就其原理來說實在是很簡單的，從本質(zhì)上說和ELISA的原理是一樣的，理解起來并不難。細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測原理，通過酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達到很高敏感度的檢測效果。 
　　ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實驗設(shè)計是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖�刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養(yǎng)一段時間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細(xì)胞激素，此時局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周圍)分泌出的細(xì)胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會留下染色斑點。 
反應(yīng)步驟可大致分為： 
       （1） 利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點； 
       （2） 加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會往附近擴散與之前包被的抗體進行特異結(jié)合； 
       （3） 洗掉細(xì)胞； 
       （4） 加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進行結(jié)合，通過底物的顯色反應(yīng)，一個細(xì)胞所在位置就會顯出斑點，最后利用顯微鏡或者特定的讀板機（reader）就可以計算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目。 
       以上是檢測分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的流程，如果是檢測分泌特異抗體的細(xì)胞只需把包被特異抗體變?yōu)榘�被特異抗原即可�?nbsp;
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ELISPOT技術(shù)實驗步驟 
    從原理上看ELISPOT的確很簡單，但是在操作過程中有許多條件需要摸索，所以這里進一步介紹一下ELISPOT的操作步驟。 
    （1） 將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4℃孵育過夜。將板用PBS洗6遍，再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基封閉，室溫下孵育至少1h。FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng)。有一種特殊的96孔板底面介質(zhì)是PVDF膜，利用膜的多孔結(jié)構(gòu)可以讓單個細(xì)胞坐到其中，然后分泌細(xì)胞因子或特定抗體，這樣使最后的檢測單個細(xì)胞靈敏度成為可能。同時，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELISA的不同之處。理論上是可以同時包被兩個不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統(tǒng)顯出不同顏色，但是這樣就要考慮到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數(shù)量要足夠。如果是使用試劑盒的預(yù)包被板，這一步就可以省略啦。 
    （2） 將陰性對照和細(xì)胞樣品，如外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)純化的CD8+T細(xì)胞或去除某種特異細(xì)胞群的PBMC，用含10%FCS的培養(yǎng)基稀釋至5×104～2×105個/孔如果條件可以達到更高的細(xì)胞數(shù)，建議可以嘗試3×105～5×105個/孔，特別是在分泌細(xì)胞），分裝于ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達產(chǎn)物，提取的抗原等，陰性對照孔中只加入培養(yǎng)基（實驗中最好采用無血清的培養(yǎng)基，這樣可以避免因為血清批次不同的差異所造成的誤差，同時也避免血清的某些成份會引起非特異的反應(yīng)），陽性對照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或陽性多肽，37℃，體積比為5% CO2培養(yǎng)24～48h。要進行ELISPOT實驗的細(xì)胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測是十分靈敏的，頻率低至10-12的分泌細(xì)胞都可以被檢測出來。并且對于那些會貼壁的細(xì)胞也可以使用此種方法，雖然細(xì)胞生長貼壁后不易被洗去，但是不會妨礙最后斑點的顯色。只要細(xì)胞可以正常分泌與抗體特異結(jié)合的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會逐步擴散到細(xì)胞四周，最后還是可以顯示出斑點。 
    （3） 用含體積比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞因子的檢測抗體，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP標(biāo)記的鏈親和素，室溫孵育3h。 
    （4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色(AKP和底物的產(chǎn)物)或紅色(HRP和底物的產(chǎn)物)斑點時，即可用立體解剖顯微鏡或計算機輔助成像分析系統(tǒng)計算斑點數(shù)，并用斑點形成單位(sfu/L百萬加入細(xì)胞)記錄結(jié)果。每一個斑點代表一個特異分泌CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測定，這時，每一個斑點代表一個分泌特異抗體的細(xì)胞。 
    完成了以上步驟后其實只是完成了實驗的一半。在你不斷摸索反應(yīng)的條件之后，得到了一塊布滿斑點的板，接下來要如何對這些斑點進行分析呢。如果利用顯微鏡人工技術(shù)無疑是太參有個人因素的實驗了，實驗結(jié)果肯定會被審稿人好好質(zhì)疑一番。隨后，有人使用數(shù)碼相機拍攝下來后，使用photoshop進行處理、計數(shù)，這種方法也存在較多的個人因素。一項技術(shù)要普及，為廣大研究人員所接受，就必需盡量減小人為的誤差。所以，近年許多公司開始開發(fā)計算機輔助系統(tǒng)，使用系統(tǒng)設(shè)定的閾值對斑點進行人工智能計數(shù)。這樣，由計算機將陰性對照中非特異反應(yīng)斑點進行去除，同時由計算機進行統(tǒng)一計數(shù)，這樣的實驗結(jié)果置信度便大大提升了。目前判斷的首要標(biāo)準(zhǔn)還是斑點的大小，但是做過電泳、同位素等的計算機成像的研究人員都遇到過一個問題：很多時候?qū)嶒灂�產(chǎn)生一些較淡的斑點，用肉眼判斷絕對是背景。所以在設(shè)計軟件時也必需考慮到斑點深淺因素。計算機可以利用斑點的深淺、是否以中心為原點向四周減淡等特征對細(xì)胞分泌動力學(xué)特征進行分析，這項技術(shù)的成熟相信會使ELISPOT的應(yīng)用范圍更加擴寬。 
   （5） ELISPOT 斑點的判讀像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當(dāng)耗時、耗勞力的工作。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活T細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專聘、有經(jīng)驗的技術(shù)員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計算斑點數(shù)仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗。 
    科學(xué)實證的本質(zhì)，在于如何使實驗結(jié)果能盡可能客觀、精確、同時有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計算法顯然無法達到此一要求。故而有幾個科研團隊使自行開發(fā)Plate Scanner與自動分析軟件，其中以Paul Lehmann教授研究開發(fā)之ImmunoSpot Analyzer自動分析儀最具代表性。分析ELISPOT實驗數(shù)據(jù)的過程中，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲存成TIF檔；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數(shù)目，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估激素分泌的多寡。預(yù)料像ImmunoSpot Analyzer這一類自動圖像掃描分析儀器，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點，徹底解除ELISPOT分析技術(shù)的瓶頸問題，進一步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用。 
    ImmunoSpot@影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數(shù)目、每個小孔中的平均斑點數(shù)目、每個小孔中斑點大小的直方統(tǒng)計圖。 

ELISPOT分析儀的出現(xiàn)解決了以下問題 
    哪些斑點是抗原特異性 T 細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點沒有 T 細(xì)胞研究價值）  
    斑點大小的意義 。 
    在對不同細(xì)胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點最大和最小尺寸。 
    如何從單個細(xì)胞基礎(chǔ)上分析 。 
    實驗精確度有多高？如果一個細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會干擾分析結(jié)果。 
    幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義。 

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ELISPOT技術(shù)優(yōu)勢及應(yīng)用 
     ELISPOT的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF)，這項技術(shù)可用于檢測并計數(shù)單個抗體形成細(xì)胞。隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測脾細(xì)胞中分泌特異性抗體的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高簡便易行。后來，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細(xì)胞數(shù)。隨后，用ELISPOT法在單細(xì)胞水平檢測分泌其他細(xì)胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6) 數(shù)量的手段也被建立起來。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性，Herr用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assisted video image analysis，CVIA)自動分析TNF2α酶聯(lián)免疫斑點的大小和數(shù)量，計算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后外周血單核細(xì)胞(PBMC)中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，不但提高了對背景染色的分辨力也使大規(guī)模研究成為可能。Vaquerano等將數(shù)碼相機和計算機結(jié)合起來，開發(fā)出類似的斑點計數(shù)系統(tǒng)，認(rèn)為當(dāng)每孔斑點數(shù)大于100時，這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時間。 
       隨著ELISPOT技術(shù)的不斷發(fā)展，它的優(yōu)勢也漸漸顯示出來，下面將列舉ELISPOT對比其它一些傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢所在。 
       ELISPOT 分析使單細(xì)胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細(xì)胞的周圍進行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細(xì)胞上的受體捕獲，或降解之前。最低至1：100萬細(xì)胞精度的活體外頻率測量。這種分辨率已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的四聚物染色和ELISA法測量的精度。這種高敏感度是非常關(guān)鍵的，因為抗原特異性 T 細(xì)胞在體外都是典型性的低頻率。高產(chǎn)量T細(xì)胞分析成為可行。一個經(jīng)過訓(xùn)練的相關(guān)實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應(yīng)。只需要少量細(xì)胞，就可以用于通其他細(xì)胞學(xué)分析方法進行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質(zhì)的反應(yīng)�？梢远�義CD4和CD8細(xì)胞的免疫因子指標(biāo)。這是因為只需要少數(shù)細(xì)胞，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進行。ELISPOT分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具。 用于確定抗原特異性T細(xì)胞的功能性親和力。這最大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響�？梢杂糜谘芯课唇�(jīng)藥物處理過的細(xì)胞的分泌過程。如果觀察到凈產(chǎn)量減少，可以確定這種區(qū)別是來自分泌細(xì)胞的減少，還是每個細(xì)胞分泌產(chǎn)量的減少。淋巴細(xì)胞在ELISPOT分析后依然存活。這使得分析之后進行增值，用于更進一步的分析、克隆或者低溫儲藏成為可能低溫儲藏后的人類淋巴細(xì)胞可以用于檢測，而不會丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進行測試，結(jié)果可以重復(fù)。 
（1） 與ELISA 
       ELISA 通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過計算機輔助的分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)， 1個斑點代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量，還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。  
與有限稀釋法（limiting dilution analysis，LDA） 
       LDA能夠?qū)μ禺愋訡TL細(xì)胞進行定量，曾在很多年中被認(rèn)為是CTL 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它使人們能夠詳細(xì)了解免疫反應(yīng)動力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorial CTL， mCTL) 亞群的細(xì)胞周期。但該方法需要高強度抗原刺激， 這會加快效應(yīng)CTL(eCTL)凋亡，且不能定量測定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養(yǎng)時間可長達2～3周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。 
（2） 與四聚體法（Tetramer） 
       最近幾年出現(xiàn)了MHC2Ⅰ類分子抗原肽四聚體法。該法的優(yōu)勢在于迅速、直接、靈敏且特異性強，即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測到準(zhǔn)確的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術(shù)也存在較多應(yīng)用上的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類分子的技術(shù)困難外，最主要缺點是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位，而MHCⅠ類分子結(jié)合的各種表位，能否形成CTL反應(yīng)，卻隨著基因背景及時間的變化而變化，因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優(yōu)勢表位的篩選可以通過Elispot 來進行，但對整個肽庫進行掃描，并不是一件很容易的事。當(dāng)然，生物信息學(xué)的運用對表位的篩選有很大的幫助。同時，有研究結(jié)果表明，并非所有經(jīng)過Tetramer 鑒定的陽性細(xì)胞都有確切的功能， Tetramer陽性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細(xì)胞數(shù)的10倍，其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細(xì)胞，可能代表了記憶型CTL前體細(xì)胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時測定其功能很重要。 
（3） 與Cr51釋放法 
       此法是一種比較經(jīng)典的方法，雖然在檢測CTL識別的抗原多樣性方面非常有效，且能精確闡明被CTL識別的最佳表位，但至多為半定量的層面，而且Cr51標(biāo)記細(xì)胞的自發(fā)釋放率較高，不適于較長時間培養(yǎng)；標(biāo)記時所需的細(xì)胞濃度較高，因而給試驗帶來諸多不便；此外，Cr51釋放法所測定的是一個細(xì)胞群體的特性，而不是單個細(xì)胞。 
（4） 與胞內(nèi)CK染色法 
       與ELISPOT法相比較，胞內(nèi)CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)累積細(xì)胞因子的染色和多色參數(shù)的FACS法，是檢測循環(huán)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測所有分泌CK的eCTL 。 

應(yīng)用 
       目前，ELISPOT已被用于檢測藥物、化學(xué)制劑及其它CK復(fù)合物的特性及功能等方面，因此為體內(nèi)免疫功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)提供了檢測依據(jù)。近幾年來， ELISPOT技術(shù)在腫瘤疫苗評價試驗、免疫監(jiān)測及免疫學(xué)研究中越來越被廣泛地使用。 

（1） 在抗腫瘤免疫及相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用 
      在許多研究中，該技術(shù)已被用于免疫動物外周血淋巴細(xì)胞中抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的數(shù)量檢測。近期，ELISPOT技術(shù)已用于分析和評價從傳染病病人的PBMC中檢測肽特異的T淋巴細(xì)胞以及在癌癥病人中誘導(dǎo)腫瘤特異的T細(xì)胞的疫苗試驗。 
ELISPOT檢測T細(xì)胞反應(yīng)時敏感性、特異性和可重復(fù)性都很高，操作簡單迅速，需要少量標(biāo)本，在檢測抗原特異性細(xì)胞數(shù)量的同時也反應(yīng)其功能，并與臨床結(jié)果相關(guān)。ELISPOT平板可以提前大量準(zhǔn)備，移液、洗板和讀板都可自動化，因而大批量檢查也可做到快速高效。在與與其他方法的比較后，ELISPOT很可能成為定量分析腫瘤或病毒特異性的T細(xì)胞反應(yīng)的首選。 
（2） 在抗感染免疫中的應(yīng)用 
       CTL在抗病毒感染的免疫應(yīng)答中占有主要地位，而CD4+輔助性T細(xì)胞亞群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起著同樣重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1類分子加工的不同抗原經(jīng)CTL識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答在控制HIV-1感染中同樣起重要作用。利用ELISPOT方法檢測CK如IFN2γ就可以進一步了解到針對HIV特異的CTL應(yīng)答及相關(guān)免疫信息。 
       此外，ELISPOT法還用于評價由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及HIVgp 120g與霍亂毒素共表達的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT還用來檢測通過直腸免疫低劑量甲肝疫苗而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在急性的自限性肝炎中，以Th1為主的應(yīng)答促進細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，且在控制病毒感染及延緩慢性疾病的發(fā)展方面有重要作用。 
       在許多抗細(xì)菌免疫研究中，該方法也發(fā)揮了重要作用。例如：應(yīng)用ELISPOT試驗證實表達大腸桿菌MalE蛋白的重組卡介苗(rBCG.MalE)誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞依賴的，rBCG.MalE 誘導(dǎo)的特異CD4+T細(xì)胞應(yīng)答存在Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，并逐步形成Th1/ Th2 混合應(yīng)答。 
（3） 臨床方面 
       目前，已經(jīng)實現(xiàn)臨床檢驗的領(lǐng)域是對肺結(jié)核（TB）的檢測。而最近的研究熱點就是對于移植的預(yù)測。受體對供體特異性HLA抗體一直以來都是器官移植的一大障礙，因為它們的存在不僅介導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)而且還可導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)。因此，HLA抗體的存在限制了異體抗原敏感患者對供體器官的需要，因而增加了等待移植的時間。在心臟，肝臟和腎臟異體移植后早期出現(xiàn)的并發(fā)癥如急性排斥反應(yīng)與移植前存在的異體免疫臨床相關(guān)性迫切需要一種恰當(dāng)?shù)臋z測方法在器官移植前能了解受體對供體特異性體液免疫的功能狀態(tài)。 
    在接受移植的人群中，部分因有多次輸血、或既往有異體移植失敗或多次妊娠史體內(nèi)曾經(jīng)存在陽性異體抗體，在他們接受異體移植時，現(xiàn)有的檢測方法只能顯示他們對異體的免疫功能正常。但他們體內(nèi)存在記憶B淋巴細(xì)胞，一旦受到相應(yīng)HLA 抗原的刺激則會喚起免疫反應(yīng)，這不僅影響著移植的結(jié)果，甚至?xí)�出現(xiàn)危及患者生命的、與移植相關(guān)的并發(fā)癥。 
    ELISPOT是一種強有效的檢測單個抗體分泌細(xì)胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激記憶B淋巴細(xì)胞增殖、分化成漿細(xì)胞，并建立一種特異性ELISPOT方法檢測HLA抗體產(chǎn)生細(xì)胞是最佳手段。 如果ELISPOT要進一步推廣應(yīng)用，特別是臨床應(yīng)用，其標(biāo)準(zhǔn)化將是一個十分重要的問題。美國FDA和NIH等已經(jīng)開始建立ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化流程，相信隨著ELISPOT技術(shù)的成熟、標(biāo)準(zhǔn)化程序的建立，它的應(yīng)用將更加廣泛。 



ELISPOT 實驗方案 

對應(yīng)BD的試劑盒 
實驗材料的準(zhǔn)備 
試劑盒中沒有但是必須的 
材料:   
• 已消毒的移液器 (Gilson)。單道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul 
• 無菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml）(Axygen)。 
• 一次性乳膠手套 。 
• 無菌一次性離心管（15ml、50ml）(Corning cat#430052 and 430290)。 
• 吸水紙(衛(wèi)生紙) 
• 無菌tip頭, 200ul,1ml, 

    試劑: 
1.        PBS 無菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在準(zhǔn)備包被抗體時不要使用商業(yè)化的PBS 
2.        ddH2O(無菌) 對于10塊ELISPOT板，200 ml 
3.        有菌洗滌緩沖液(PBST)：有菌3000ml/10板 
Tween-20 進口 
4.        有菌洗滌緩沖液(PBS)：有菌1000ml/10板 
5.        培養(yǎng)液：無血清培養(yǎng)基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。 
6.         PMA ＋ionomycin. 
    Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended). 
PMA  
貯 存 液：PMA溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存 
工 作 液：貯存液 1:4000稀釋于無血清培養(yǎng)基中 
此時為 250ng/ml  
 Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended). 
Ionomycin  
貯 存 液：Ionomycin溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存 
工 作 液：貯存液 1:200稀釋于無血清培養(yǎng)基中 
此時為 5μg/ml  
50ml混合刺激劑＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，無血清培養(yǎng)基補齊 


7.        10% 熱滅活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 ) 
8.        抗原 
      
設(shè)備: 
• 洗板器: 自動或手動 (洗瓶, 手動分液器等)。 
•專用CO2-細(xì)胞培養(yǎng)箱 (37°C)。 
4°C冰箱 
無菌間無菌操作臺 



Preparation kit reagents   
1．包被用抗體 
取50 μl加到10ml PBS中。（足夠包被1塊96孔板，100 μl/well）。 
對10塊板子， 500ul加到100ml PBS中 
2．生物素標(biāo)記的檢測抗體（detector antibody） 
取50μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/well）。 
對10塊板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS) 
3．STREP-HRP 
取100μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。 
對10塊板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer 

4 顯色激活系統(tǒng)（Activation system） 
對于1塊ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，10分鐘內(nèi)用完。（100 μl/孔）。 

ELSPOT實驗步驟 
Day 1  
包被ELISPOT板 16：30 

1.        在ELISPOT板中每孔加入包被抗體100μl，4℃ 過夜。 
Day 2 
ELISPOT板的封閉  17：00 

2.        取出已包被的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。 
3.        用完全無血清培養(yǎng)基洗1次。 
4.        在ELISPOT板中，每孔加入200μl完全無血清培養(yǎng)基。室溫2h。(8道排槍) 
5.          
PBMC加入ELISPOT培養(yǎng)板 20：00 

6.        取出封閉2h的ELISPOT板，吸棄每孔中的封閉液。(不要洗板！) 
7.        在ELISPOT板中，先加30μl 無血清培養(yǎng)基(12道排槍)和20μl肽庫(8道排槍)，后加50μl細(xì)胞(8道排槍) (每孔活細(xì)胞總數(shù)為2×105，每個病人需活細(xì)胞總數(shù)為10×106，體積為2.5 ml。每條多肽的終濃度為5μg/ml，活細(xì)胞的工作濃度為4×106/ml，活細(xì)胞的終濃度為2×106/ml）。 
陽性孔中每孔加入50μl 細(xì)胞和30μl無血清培養(yǎng)基和20μl PMA+Inomysin（工作液濃度分別為250ng/ml和5ug/ml，終濃度分別為50ng/ml和1ug/ml）。 
8.        用low evaporation lid 蓋好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)30 h。 
注意：不要晃動ELISPOT板。 

Env1	Env1	Pol1	Pol1	Vif	Vif	Env1	Env1	Pol1	Pol1	Vif	Vif
Env2	Env2	Pol2	Pol2	陰對	陰對	Env2	Env2	Pol2	Pol2	陰對	陰對
樣本 1 Env3	Env3	Pol3	Pol3	陰對	陰對	樣本2 Env3	Env3	Pol3	Pol3	陰對	陰對
Env4	Env4	Pol4	Pol4	陰對	陰對	Env4	Env4	Pol4	Pol4	陰對	陰對
Env5	Env5	Pol5	Pol5	陰對	陰對	Env5	Env5	Pol5	Pol5	陰對	陰對
Gag1	Gag1	Nef	Nef	陰對	陰對	Gag1	Gag1	Nef	Nef	陰對	陰對
Gag2	Gag2	Tat REV	Tat REV	樣本陽對	樣本陽對	Gag2	Gag2	Tat REV	Tat REV	樣本陽對	樣本陽對
Gag3	Gag3	Vpu Vpr	Vpu Vpr	樣本陽對	樣本陽對	Gag3	Gag3	Vpu Vpr	Vpu Vpr	樣本陽對	樣本陽對

Day 4  
二抗和GABA標(biāo)記，顯色反應(yīng) 8：30 
9.        培養(yǎng)30h后，取出ELISPOT板，甩去細(xì)胞后。 
10.    用去離子水洗滌2次。每次浸泡5分鐘。 
11.    用0.05％PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘。 
12.    每孔加入100μl 生物素化的detector Ab(8道排槍)。室溫2小時。 
13.    取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘 
每孔加入100μl Strep-HRP溶液(8道排槍)。室溫1小時 
14.    取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。 
15.    PBST洗滌4次。每次浸泡2分鐘。 
16.    用PBS洗滌2次。每次浸泡2分鐘。 
17.    洗滌完畢后，在吸水紙上輕輕拍干ELISPOT板。 
每塊板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，15分鐘內(nèi)用完。 
18.    每孔加入100 µl 配好的substrate(8道排槍)。在暗處、室溫下孵育（5～60分鐘）。 
出現(xiàn)斑點后，用自來水沖洗，中止反應(yīng)。室溫下干燥，檢測。