RNAi的機(jī)理與應(yīng)用

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RNAi 技術(shù)的機(jī)理與應(yīng)用

關(guān)于 RNAi 技術(shù)

RNA 干擾（RNA interference,RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA( double-stranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。

RNAi 受到追捧的原因主要有兩個(gè)方面，一方面， RNAi 可以說(shuō)是基因功能檢驗(yàn)的試金石，利用 RNAi 技術(shù)可以縮短人類(lèi)對(duì)人類(lèi)基因功能的了解和認(rèn)識(shí)的時(shí)間，在不久的將來(lái)有望將人類(lèi)大部分基因的功能和作用全部弄清楚；另一方面，科研人員有望利用這種技術(shù)獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是生物技術(shù)界追捧的對(duì)象。

2002年，《自然》及《科學(xué)》兩本重量級(jí)學(xué)術(shù)期刊把 RNA干擾技術(shù)視為生命科學(xué)領(lǐng)域重大突破，認(rèn)為足以比肩 20 世紀(jì)早期發(fā)現(xiàn)抗生素，開(kāi)啟了基因治療的另一個(gè)方向。

2006年10月，2006年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)被授予美國(guó)斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授安德魯·菲爾和馬薩諸塞州醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授克雷格·梅洛，表彰他們發(fā)現(xiàn) RNAi機(jī)理。

RNAi迄今已對(duì)制藥業(yè)和生物技術(shù)工業(yè)產(chǎn)生巨大影響。這也是諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)為什么不堅(jiān)持研究成果要經(jīng)過(guò)數(shù)十年實(shí)踐驗(yàn)證的“慣例”，破格為菲爾和梅洛頒獎(jiǎng)的原因之一。

目前，RNA干擾治療技術(shù)正在快速進(jìn)入人體試驗(yàn)階段，已有多個(gè) siRNA 藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，其中第一個(gè)RNAi藥物 Bevasiranib（美國(guó) Acuity Pharmaceuticals 公司）已處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段，有望于 2009 年獲準(zhǔn)上市。

RNAi 機(jī)理

遺傳物質(zhì) ，化學(xué)名稱(chēng)是“脫氧核糖核酸”，簡(jiǎn)稱(chēng) DNA 。 DNA 包含約二萬(wàn)多個(gè)蛋白質(zhì)的密碼。當(dāng)細(xì)胞決定要制造某一個(gè)蛋白質(zhì)之時(shí)，屬于該蛋白質(zhì)的 DNA 密碼便會(huì)被“影印”（專(zhuān)業(yè)上稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄 Transcription ），做成一份核糖核酸的“副本” RNA ，又叫 mRNA 。 mRNA 副本會(huì)去細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)“工廠(chǎng)”（核糖體〔 Ribosome 〕），然后，按次序?qū)⒍N胺基酸組合成一個(gè)蛋白質(zhì)�！�

一些病毒覷準(zhǔn)上述機(jī)制，把病毒的 RNA 送入細(xì)胞，借其核糖體，生產(chǎn)自己的蛋白質(zhì)。這些以 RNA 儲(chǔ)存遺傳訊息的病毒，進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)用一個(gè)自備的酶把 RNA 制造一個(gè) DNA 的副本，以便可以銜接細(xì)胞“ DNA - mRNA - 蛋白質(zhì)”的生產(chǎn)程序。對(duì)此，細(xì)胞也有對(duì)策。方法是用一個(gè)叫 Dicer 的酶，把入侵病毒的 RNA 切成很多小段；之后，這些小段 RNA 會(huì)很自然地、自動(dòng)黏在它的 mRNA 上，干擾核糖體制造病毒的蛋白質(zhì)。這便是一個(gè)細(xì)胞保護(hù)自己的機(jī)制，稱(chēng)為 RNA 干擾（ RNA Interference － RNAi ）。

RNAi 是真核生物中一種普遍存在且非常保守的機(jī)制 , 是一個(gè)天然的抗病毒機(jī)制。 RNAi 的作用機(jī)制可簡(jiǎn)述為“雙鏈 RNA 降解 mRNA 從而阻斷特定蛋白質(zhì)的合成”，具體過(guò)程如下圖：

首先，外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的長(zhǎng)雙鏈 RNA(long double stranded RNA, dsRNA) 首先被 Dicer 酶降解為長(zhǎng) 21 ～ 23bp （堿基對(duì)）長(zhǎng)度的小分子雙鏈 RNA （稱(chēng)為小干擾核酸， small interfering RNA, siRNA), 這是一個(gè)依賴(lài) ATP 的耗能過(guò)程。切割后的 siRNA 具有 3' 兩個(gè)核苷酸 TT 突出末端。

然后， siRNA 結(jié)合到核糖核酸酶復(fù)合物上形成 RNA 誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（ RISC ， RNA-induced silencing complex ）。該復(fù)合體依賴(lài) ATP 釋能而解聚 siRNA 雙鏈成單鏈以激活 RISC �；罨� RISC 通過(guò)由 siRNA 決定的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，最終導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)。

同時(shí)， RNAi 過(guò)程中又有新的 dsRNA 分子合成 , 當(dāng) siRNA 反義鏈識(shí)別并結(jié)合靶 mRNA 后 , siRNA 反義鏈可作為引物 , 以靶 mRNA 為模板，在依賴(lài)于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的 dsRNA , 然后由 Dicer 切割產(chǎn)生新的 siRNA , 新 siRNA 再去識(shí)別新一組 mRNA, 又產(chǎn)生新的 siRNA, 經(jīng)過(guò)若干次合成切割循環(huán) , 沉默信號(hào)就會(huì)不斷放大。正是這種稱(chēng)為靶序列指導(dǎo)的擴(kuò)增 (target2directed amplification) 機(jī)制賦予了 RNAi 的高效性和持久性。

siRNA 作為 RNAi 的中介分子，是一種具有 3' 兩個(gè)核苷酸 TT 突出末端的 21 ～ 23bp 大小的雙鏈核糖核酸，通過(guò)序列互補(bǔ)配對(duì)法則特異性降解目的基因。

RNAi 應(yīng)用

RNAi 作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達(dá)的工具， RNAi 的應(yīng)用主要集中在兩個(gè)方面：基因功能的研究、核酸干擾（RNAi）治療。

• 基因功能研究

二十世紀(jì)最偉大的生物工程 --- 人體基因組工程，在美國(guó)主導(dǎo)和全球共同合作下，歷經(jīng) 15 年，耗資 300 億美元，于 2000 年成功地將人體基因組的 30 億個(gè)基因密碼解析出來(lái)。雖然對(duì)總數(shù)約 3 萬(wàn)的人體基因的結(jié)構(gòu)己清楚，但對(duì)于各種基因產(chǎn)物的功能如何？怎么在人體中發(fā)揮作用？哪些和疾病關(guān)聯(lián)以及如何用于治療疾病等諸如此類(lèi)的問(wèn)題還是束手無(wú)策。

與此同時(shí)，用基因工程學(xué)的方法修正或替換缺陷基因的基因療法已成為基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱門(mén)課題。而實(shí)施基因療法的前提是了解疾病相關(guān)基因 , 并用特定技術(shù)，如基因敲除 (gene knock-out) 驗(yàn)證其功能。

借助 RNAi 技術(shù)，研究者們可對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特異性地表達(dá)沉默，通過(guò)觀(guān)察其表達(dá)被抑制后細(xì)胞以至生物體從形態(tài)到各項(xiàng)生理生化的變化，對(duì)該基因的功能及參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。與其他方法相比， RNAi 技術(shù)在基因功能研究上有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn) : ①簡(jiǎn)單易行 , 容易開(kāi)展； ②與基因敲除相比，實(shí)驗(yàn)周期短、成本低；③與反義技術(shù)相比，具有高度特異性和高效性； ④可進(jìn)行高通量 (high throughout) 基因功能分析。

• RNAi治療

由于 RNAi 是針對(duì)轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對(duì)于傳統(tǒng)基因治療對(duì)基因水平上的敲除，整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開(kāi)辟了新的途徑。其總體思路是通過(guò)加強(qiáng)關(guān)鍵基因的 RNAi 機(jī)制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。

因此，尋找能導(dǎo)致特定基因沉默的 siRNA ，即可以此開(kāi)發(fā)出特異性的高效 siRNA 藥物。目前，多數(shù)藥物的作用靶點(diǎn)為蛋白質(zhì) , 要研制這類(lèi)藥物必須對(duì)蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)有深入了解 , 而研制以 mRNA 為靶點(diǎn)的 RNAi 療法則不會(huì)受制于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的進(jìn)展。

RNAi 專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)

核酸干擾（RNA interference, RNAi）

核酸干擾是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA ( double-stranded RNA ， dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。 RNAi 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學(xué)研究領(lǐng)域最為活躍的熱點(diǎn)之一，《 Science 》在 2001 年將其列為十大科學(xué)成就之一， 2002 年又將其列為十大科技之首；《 Nature 》也將 siRNA 評(píng)為 2002 年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一； 2006 年發(fā)現(xiàn) RNAi 機(jī)理的兩位美國(guó)科學(xué)家法爾和梅洛獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

RNAi 技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，是一種快速、有效、特異的抑制基因表達(dá)的工具，已被廣泛用于探索基因功能、病毒性疾病（主要是艾滋病和肝炎）及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。一方面， RNAi 是基因功能檢驗(yàn)的試金石，利用 RNAi 技術(shù)可以大幅度縮短人類(lèi)對(duì)人類(lèi)基因功能與作用的了解和認(rèn)識(shí)的時(shí)間；另一方面，可以利用 RNAi 技術(shù)獲得使致病基因失活的新型基因藥物，即 siRNA 藥物。

小干擾核酸（siRNA）

小干擾核酸（英文縮寫(xiě)：siRNA ；中文簡(jiǎn)稱(chēng)：小核酸）是帶有特定基因密碼的雙鏈短小核酸，一般長(zhǎng)度為 21-23bp （堿基對(duì)）。通俗地講，一個(gè)基因通常含有有數(shù)千個(gè) bp ， siRNA 是其中長(zhǎng)度為 21 ～ 23bp 的某一段特異序列。

siRNA 可以克隆到 siRNA 表達(dá)載體，其功能是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)和特定靶基因的信使核糖核酸（ mRNA ）結(jié)合，使之降解，失去靶基因表達(dá)而“沉默”下來(lái)，即“關(guān)閉”該基因的功能。這種 siRNA 降解 mRNA 從而阻斷特定蛋白質(zhì)合成的機(jī)制即為核酸干擾（ RNAi ）。

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