GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts

Keywords: DNA damage response; GDF15; inflammatory mechanoresponse; orthodontic tooth movement; periodontal ligament fibroblasts; senescence; zoledronic acid.

在正畸牙齒移動（OTM）期間，通過正畸矯治器施加機械力來促進牙周膜（PdL）重塑和牙槽骨的生理適應。這些力觸發(fā) PdL 細胞的機械生物學反應，促進局部無菌和短暫的炎癥微環(huán)境，從而導致組織和骨骼重塑。因此，壓縮力通常通過誘導缺氧和激活牙周膜成纖維細胞（PdLFs）的促炎反應來促進骨吸收，包括增加細胞因子，如白細胞介素1β（IL-1β）、IL6、IL8 和環(huán)氧合酶2（COX2）。

生長/分化因子15（GDF15）是 TGF-β/BMP 超家族的成員，在代謝、機械或化學應激期間由各種細胞類型和組織釋放，在 OTM 中也起主要作用。GDF15 可在被機械刺激的人牙周膜成纖維細胞（hPdLFs）中上調，并促進其促炎反應。除了調節(jié) PdL 中成骨細胞分化和炎癥外，GDF15 還參與細胞死亡和細胞衰老以及衰老的調控。

OTM 可受到多種藥物的干擾，這些藥物也可能誘發(fā)影響骨吸收或附著過程的功能障礙。其中一種藥物是雙膦酸鹽類（BP）唑來膦酸（ZOL），主要用于治療癌性骨轉移、骨代謝疾病以及骨質疏松癥。已有研究描述了ZOL 對幾種細胞類型細胞活力和增殖能力的影響，尤其是破骨細胞，其對DNA損傷反應和衰老誘導的影響也在幾種細胞類型中得到闡釋。然而，OTM 期間 ZOL 對 PdLFs 機械相關功能的確切影響尚未得到充分研究。

因此，德國耶拿大學附屬醫(yī)院口腔正畸科、保守牙科和牙周病學系老年牙科課題組的一項研究旨在表征 ZOL 對人牙周膜成纖維細胞調節(jié)的炎癥機械反應的作用，并進一步確定 GDF15 的潛在影響。研究成果發(fā)表在 CELLS 期刊題為“GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts”。

首先，評估了 hPdLFs 暴露于不同濃度 ZOL（0.5 μM、5 μM、50 μM）的反應。MTT測定分析表明，與對照組相比，在為期兩天 ZOL 處理的 hPdLFs 中檢測到代謝活性水平降低（圖1 a），且最高的 ZOL 濃度導致最低的代謝活性。進一步對hPdLFs 進行臺盼藍染色（圖1 b），發(fā)現隨著 ZOL 濃度的增加，觀察到更多的臺盼藍-陽性細胞，表明 ZOL 具有細胞毒作用。增殖標志物 Ki67 免疫熒光染色顯示，隨著 ZOL 濃度的增加，增殖成纖維細胞的數量減少，表明 ZOL 對 hPdLFs 細胞增殖具有限制作用（圖1 c、d）。

由于特定刺激會觸發(fā) PdL 成纖維細胞向成骨細胞分化，因此，研究了 ZOL 對其細胞命運的影響。對成骨標志基因 ALP 和 RUNX2 進行定量表達分析（圖1 e、f），發(fā)現ZOL 處理 48 小時后未檢測到基因轉錄的顯著差異。此外，檢測了反映成骨細胞活性的 ALP 活性水平（圖1 g、h），與成骨標志物的表達水平一致，ZOL 暴露后也未觀察到鈣沉積的顯著變化。這些數據表明，唑來膦酸劑量依賴性地限制了 PdL 成纖維細胞的活力和增殖，而不會影響這些細胞的成骨分化。

圖1 唑來膦酸限制了人 PdL 成纖維細胞的細胞活力和增殖。

鑒于唑來膦酸對不同細胞類型中 DNA 損傷反應（DDR）的影響以及這種應激反應在 PdL 健康和功能中的相關作用存在相互矛盾的結果，因此，接下來專注 ZOL 處理的 hPdLFs 中的 DDR 激活。

TUNEL法（斷裂DNA 分析）檢測 ZOL 處理引起的 DNA 鏈斷裂，揭示了 DNA 損傷的劑量依賴性增加。磷酸化的 H2A.X 是 DDR 激活的標志，免疫熒光染色顯示，ZOL 導致 hPdLFs 中 H2A.X 的磷酸化速率以劑量依賴性方式升高，這表明 hPdLFs 中的 DDR 激活增強。

DDR 信號的持續(xù)激活可能會觸發(fā)細胞衰老，損害 hPdLFs 的功能。為了驗證這一點，對衰老相關細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑 p21WAF1/CIP1/SDI1進行了免疫熒光染色。由于 ZOL 暴露，在 hPdLFs 中檢測到 p21 強度的劑量依賴性增加（圖2 a、b），表明向衰老細胞命運的轉變。進一步分析衰老相關標志物 β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性，證實了 ZOL 處理的 hPdLFs 的衰老增加（圖2 c、d）。此外，檢測到衰老相關細胞因子如 IL6、IL8 和 COX2 的表達增加，以及 GDF15 表達的增加（圖2 e）。

這些數據表明，唑來膦酸通過誘導 DNA 鏈斷裂來誘導相關的應激反應，這可能導致細胞存活率降低并促進 hPdLFs 的細胞衰老。圖2 ZOL 處理促進 hPdLFs 的細胞衰老。

向衰老表型的轉變可能會顯著影響 hPdLFs 的功能，這可能與在正畸牙齒移動過程中組織和骨骼重塑相關。因此，研究人員旨在研究 ZOL（5 μM）對 hPdLFs 機械反應的影響，更具體地關注促炎過程的誘導和 OCs 的激活。

在施加 24 小時的壓縮力（2 g/cm2）后，確定 ZOL 處理的 hPdLFs 的炎癥機械反應譜的差異，對編碼力調節(jié)的細胞因子的基因進行定量表達分析（圖3 a）。施加壓縮力后，檢測到所有分析基因（IL1B、IL6、IL8、COX2 和 GDF15）的表達水平增加（圖3 a）。雖然 IL8 和 COX2 沒有顯示 ZOL 依賴性變化，但 IL1B、IL6 和 GDF15 水平顯著增強，表明與 ZOL 相關的特異性促炎特征增強（圖3 a）。

為了從功能上檢查機械刺激的 ZOL 暴露的成纖維細胞的炎癥反應，進一步研究了免疫細胞的激活（圖3 b、c）。在與刺激的 hPdLFs 共培養(yǎng)實驗中，當感應到促炎信號時，非貼壁單核細胞 THP1 細胞分化為貼壁巨噬細胞。因此，在壓縮刺激的 ZOL 處理的 hPdLFs中，貼壁 THP1 細胞的數量顯著增加，證實了暴露于唑來膦酸的 PdL 成纖維細胞的高炎性機械反應。

由于 GDF15 在調節(jié) hPdLFs 對壓縮刺激的促炎反應中有重要功能，最后，研究了其在壓縮力下 ZOL 處理的 hPdLFs 過度炎癥反應中的潛在作用。在ZOL 處理后，壓縮力刺激前使用 siRNA 介導的基因沉默敲低 GDF15，發(fā)現其RNA（圖3 d）、蛋白質（圖3 e、f） 和分泌（圖3 g）表達降低。在 GDF15 缺失的情況下，壓縮力刺激的 hPdLFs 中，ZOL 誘導的 IL1B 和 IL6 表達增加被減弱（圖3 d）。此外，在 GDF15 缺失的 hPdLFs 中，ZOL 依賴性的免疫細胞活化上調被降低（圖3 h、i），這特別表明了 GDF15 在響應 ZOL 治療中具有深遠的促炎作用。

這些數據表明，ZOL 改變的細胞特征確實會干擾 hPdLFs 的生物力學功能，并且 GDF15 在此過程中起著至關重要的作用。圖3 ZOL 誘導了部分受 GDF15 調節(jié)的高炎癥機械反應。

總之，該研究表明，唑來膦酸鈉可以通過直接抑制骨吸收細胞來抑制牙齒移動，通過影響牙周膜成纖維細胞的細胞特性和機械生物學功能來間接影響它們的激活。研究證明了唑來膦酸特異性觸發(fā) DNA 損傷和細胞衰老，潛在性的觸發(fā)過度炎癥機械反應，降低破骨細胞活化。然而，這可能會在雙膦酸鹽患者的正畸治療中引發(fā)潛在的負面作用。GDF15 作為促進這些 ZOL 相關變化的潛在調節(jié)因子，將是未來OTM患者特異性治療策略的可能靶點。

參考文獻：Nitzsche A, Hennig CL, von Brandenstein K, Döding A, Schulze-Späte U, Symmank J, Jacobs C. GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts. Cells. 2024 Jan 12;13(2):147. doi: 10.3390/cells13020147. PMID: 38247838; PMCID: PMC10814077.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38247838/

Impact Factor: 5.1 (2023); 5-Year Impact Factor: 6.0 (2023)

ISSN: 2073-4409

圖片來源： 所有圖片均來源于參考文獻

小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！進入官網www.naturethink.com或關注“Naturethink”公眾號，了解更多相關內容。

點擊了解：細胞壓力培養(yǎng)儀