Keywords：Free fat soluble vitamins; Serum; Plasma; In Vitro Diagnostics; IVD
體外診斷（In Vitro Diagnostics, IVD）是一種醫(yī)療檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于各種疾病的預(yù)防、診斷、療效觀察等方面，對(duì)于提高診斷的準(zhǔn)確性、治療的有效性等情況，具有積極的意義。它通過(guò)分析人體的體液、細(xì)胞或組織樣本，為醫(yī)生提供了寶貴的診斷信息，進(jìn)而輔助制定治療計(jì)劃。為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，合適的樣本選擇至關(guān)重要！

血液類樣本作為體外診斷最主要的樣本類型之一，因其組分的不同可以做不同的項(xiàng)目，然而，在臨床診斷中研究者發(fā)現(xiàn)在一些疾病診斷中，血清（Serum）或血漿（Plasma）中的脂溶性維生素（Fat Soluble Vitamins）的含量會(huì)干擾對(duì)其他指標(biāo)的判斷。因此，為了準(zhǔn)確測(cè)定其他物質(zhì)的含量或指標(biāo)的變化，需將血清或血漿中的脂溶性維生素去除。

一、基本定義
脂溶性維生素(Fat Soluble Vitamins)是不溶于水而溶于脂肪及非極性有機(jī)溶劑(如苯、乙醚及氯仿等)的一類維生素，包括維生素A、維生素D、維生素E、維生素K。這類維生素一般只含有碳、氫、氧三種元素，在食物中多與脂質(zhì)共存，其在機(jī)體內(nèi)的吸收通常與腸道中的脂質(zhì)密切相關(guān)，可隨脂質(zhì)吸收進(jìn)入人體并在體內(nèi)儲(chǔ)存(主要在肝臟)，排泄率不高；攝入量過(guò)多易引起中毒現(xiàn)象，若攝入量過(guò)少則緩慢出現(xiàn)缺乏癥狀。另外，脂溶性維生素大多穩(wěn)定性較強(qiáng)。下表為4種脂溶性維生素主要作用。

種類	作用
維生素A	1.增強(qiáng)視網(wǎng)膜感光力參與視紫紅質(zhì)的合成，缺乏時(shí)視紫紅質(zhì)合成減少，對(duì)弱光敏感性降低，在弱光下視物模糊，稱為夜盲癥； 2.維持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整性和功能參與糖蛋白合成，缺乏時(shí)可引起上皮干燥、增生及角化，如皮脂腺角化，出現(xiàn)丘疹；淚腺細(xì)胞角化，淚液分泌減少，眼部干燥，稱為眼干燥癥； 3.促進(jìn)機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育促進(jìn)骨細(xì)胞的分化，維持成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞之間的平衡；促進(jìn)蛋白質(zhì)、黏多糖及類固醇的合成，缺乏時(shí)組織生長(zhǎng)發(fā)育不良； 4.促進(jìn)吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；有效抑制氧自由基的活性，保護(hù)細(xì)胞免受傷害，具有一定的癌癥預(yù)防作用。
維生素D	1.促進(jìn)鈣、磷在小腸和腎小管的吸收，維持正常穩(wěn)定的血鈣和血磷濃度； 2.在甲狀旁腺素和降鈣素的協(xié)同下，促進(jìn)骨鈣入血，維持血鈣和血磷的平衡； 3.促使鈣沉著于新骨形成部位，促進(jìn)生長(zhǎng)和骨骼鈣化，促進(jìn)牙齒健。
維生素E	1.抗氧化作用能抑制不飽和脂肪酸的氧化，減少過(guò)氧化脂質(zhì)的形成以及對(duì)機(jī)體生物膜的損害，有抗衰老、抗癌及防止動(dòng)脈粥樣硬化作用； 2.維持和促進(jìn)生殖功能使促性腺激素分泌增加，促進(jìn)精子生成和運(yùn)動(dòng)，增加卵泡生長(zhǎng)和孕酮的分泌； 3.參與多種酶活動(dòng)增強(qiáng)微粒體中混合功能氧化酶的活性，抑制脫氧核糖核酸等分解酶系統(tǒng)，并對(duì)含巰基酶有保護(hù)作用； 4.其他維持毛細(xì)血管的正常通透性，增加血流量，修復(fù)血管壁損傷后的瘢痕，抑制血小板聚集，防止血栓形成；維持骨骼肌、心肌和平滑肌的正常結(jié)構(gòu)和功能。
維生素K	1.可以促進(jìn)肝臟合成四種凝血因子，凝血酶原、轉(zhuǎn)變加速因子，抗血友病因子，促進(jìn)血液凝固； 2.可增強(qiáng)腸蠕動(dòng)和分泌功能，延緩糖皮質(zhì)激素在肝內(nèi)分解，并有類似氫化可的松的作用，長(zhǎng)期注射維生素K可增強(qiáng)甲狀腺的內(nèi)分泌活性等； 3.可以舒張內(nèi)臟平滑肌，緩解腎絞痛、膽絞痛、泌尿系出血，臨床上常用其注射劑治療血尿、尿結(jié)石、膽結(jié)石發(fā)作時(shí)，能解痙鎮(zhèn)痛。

由上可知，脂溶性維生素主要儲(chǔ)存于肝臟組織中，但在個(gè)體其余組織或體液中也均有存在，包括作為體外診斷主要樣本類型之一的血液樣本。血液樣本包含全血、血清和血漿三種類型，其中全血由血細(xì)胞和血漿組成，應(yīng)用于臨床血液學(xué)檢查，如紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類和形態(tài)學(xué)檢查等；血漿是血液加入抗凝劑后，經(jīng)離心分離得到的液體，含有纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白以及各種凝血因子，這些成分共同維持著血液的凝固功能；而血清則是血液在體外自然凝固或加促凝劑后分離出的淡黃色透明液體，它主要含有白蛋白、球蛋白及各種無(wú)機(jī)離子。



血清或血漿中的生理成分與機(jī)體組織間液比較接近，更能真實(shí)地反應(yīng)機(jī)體的生理情況，反應(yīng)其病理改變也更加靈敏。因此，在某些疾病診斷中，為避免脂溶性維生素對(duì)于特定疾病或研究的影響，合理的去除血清或血漿中的脂溶性維生素顯得尤為重要！

二、去除脂溶性維生素的方法
由上可知，在一些特殊情況下，需采用合理的方法將血清或血漿中的脂溶性維生素去除，本文以去除維生素D為例，簡(jiǎn)要的描述4種從血清或血漿中去除維生素D的工藝，僅供參考。

工藝	方法	優(yōu)缺點(diǎn)
有機(jī)溶劑提取法	取一定量的血漿或血清樣本，加入適量的乙酸乙酯或氯仿，震蕩，使有機(jī)溶劑與維生素D充分混合，離心即可得到不含維生素D的血漿或血清	優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單：步驟較少，易于實(shí)施。 成本低：所需試劑和設(shè)備較為常見。 缺點(diǎn)：選擇性差：可能同時(shí)提取其他脂溶性物質(zhì)。 溶劑殘留：可能影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
透析法	使用特定孔徑的透析膜，置于緩沖液中，維生素D無(wú)法通過(guò)微孔膜，遂去除	優(yōu)點(diǎn)：溫和，不破壞樣品中的蛋白質(zhì)和其他大分子； 操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜設(shè)備。 缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要數(shù)小時(shí)至數(shù)天； 效率低：對(duì)小分子去除效果有限。
固相萃�。⊿PF）法	使用C18或其它反相柱，先吸附基質(zhì)中的脂溶性成分，而后用有機(jī)溶劑洗脫	優(yōu)點(diǎn)：選擇型好，能有效分離脂溶性物質(zhì)； 樣品損失少：回收率較高。 缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，步驟較多，需優(yōu)化條件； 成本較高，固相萃取柱價(jià)格較貴。
色譜法	使用高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜（GC）分離并去除維生素D	優(yōu)點(diǎn)：高分離度，能精確分離復(fù)雜樣品中的特定成分； 靈敏度高，適合微量分析。 缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，需用專業(yè)儀器； 操作復(fù)雜，需專業(yè)人員操作。
免疫吸附法	使用抗維生素D的抗體，通過(guò)免疫吸附去除基質(zhì)中的維生素D	優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，抗體能特異性結(jié)合維生素D； 高效，去除效果顯著。 缺點(diǎn)：成本高，抗體價(jià)格昂貴； 操作復(fù)雜，需優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。
物理吸附法	先用水解試劑使與蛋白質(zhì)結(jié)合的維生素D分離，使其游離，再利用活性炭等物理方法進(jìn)行吸附去除	優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，成本較低，無(wú)化學(xué)污染，廣譜吸附性，可調(diào)節(jié)性強(qiáng)。 缺點(diǎn)：受環(huán)境影響較大，吸附選擇性差。

綜上所述，不同方法具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，IPHASE結(jié)合實(shí)際，選用物理吸附法去除維生素D，并使用LC-MS/MS進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如下。圖1為IPHASE技術(shù)人員定量本司維生素D質(zhì)譜檢測(cè)下限為0.5ng/ml，并以此為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得圖2實(shí)際產(chǎn)品圖譜，圖片顯示IPHASE此次分離去除維生素D的空白生物基質(zhì)其VD含量小于0.5ng/ml，因此，可證明IPHASE技術(shù)人員已成功去除血清中的維生素D，該產(chǎn)品符合要求。