研究背景：

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）是常見的心律失常，與心臟和心外危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，其中與睡眠紊亂密切相關(guān)。睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）在現(xiàn)代社會(huì)普遍存在，嚴(yán)重影響公眾健康，研究表明睡眠異常會(huì)增加房顫風(fēng)險(xiǎn)，但具體機(jī)制仍有待深入探索。

褪黑素（melatonin，MLT）因抗氧化等特性對多種疾病有治療潛力，在抗心律失常方面也有作用，不過在肥胖人群中卻可能增加房顫易感性，作用機(jī)制尚不明確。心肌細(xì)胞鈣動(dòng)力學(xué)對心臟至關(guān)重要，鈣穩(wěn)態(tài)失衡與房顫緊密相連。本研究旨在探究MLT能否通過降低線粒體氧化應(yīng)激等，減輕睡眠剝奪引發(fā)的大鼠房顫，為睡眠相關(guān)心律失常治療提供新方向。

基于此，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院湯寶鵬教授團(tuán)隊(duì)近期在International Immunopharmacology雜志上發(fā)表"Melatonin lessens the susceptibility to atrial fibrillation in sleep deprivation by ameliorating Ca²⁺ mishandling in response to mitochondrial oxidative stress"的相關(guān)文章。

文中首次提供了MLT減輕SD誘導(dǎo)的AF易感性的證據(jù)。這種作用是通過抑制ox-CaMKII/RYR2介導(dǎo)的RyR2相關(guān)的肌漿網(wǎng)鈣積累來實(shí)現(xiàn)的。此外，MLT通過調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激相關(guān)的纖維化、炎癥和凋亡來減少心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。雖然這些發(fā)現(xiàn)揭示了MLT的潛在抗心律失常途徑，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

研究方法：
本文采用多通道電生理標(biāo)測技術(shù)（Electrical Mapping）分別檢測Control組、SD組、SD+MLT組大鼠的有效不應(yīng)期、傳導(dǎo)速度、傳導(dǎo)速度離散度等指標(biāo)，此外，還應(yīng)用了高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)（Optical Mapping）來檢測Control組、SD組、SD+MLT組大鼠離體心臟的動(dòng)作電位以及鈣瞬變信號的變化。

研究結(jié)果：
1. MLT減輕了SD誘導(dǎo)的心房電重構(gòu)
為了研究房顫的易感性，我們應(yīng)用S1-S1刺激評估不同組大鼠房顫易感性，應(yīng)用S1-S2刺激來測量心房的有效不應(yīng)期（AERP）。結(jié)果表明，SD后房顫的誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間增加，而MLT給藥可緩解這些影響；值得注意的是，與對照組相比，SD顯著縮短了心房有效不應(yīng)期（AERP），而MLT治療后AERP恢復(fù)。此外，SD顯著減緩心房心外膜電傳導(dǎo)速度，增加左心房電傳導(dǎo)不均一性，而MLT治療有效地逆轉(zhuǎn)了這些變化，這提示外源性MLT可能抵消了睡眠剝奪引起的不良心臟電生理改變。（圖1）

圖1 MLT減輕了SD誘導(dǎo)的心房電重構(gòu)

2. MLT減輕了SD誘導(dǎo)的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)
除了電生理學(xué)的改變外，我們還研究了MLT在緩解睡眠剝奪引起的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的作用。超聲心動(dòng)圖顯示，MLT減輕了睡眠剝奪引起的左心房增大。然而，其他超聲心動(dòng)圖參數(shù)，如LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS和rad，在對照組和睡眠剝奪組之間，無論有無MLT，都沒有顯著差異。HE染色的組織學(xué)分析顯示，睡眠剝奪組大鼠的心肌橫截面積和心肌細(xì)胞肥大增加，而MLT可減輕這些癥狀。Masson三色染色顯示，與對照組相比，MLT降低了睡眠剝奪大鼠心肌纖維化�？紤]到心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致心肌纖維化，我們采用TUNEL染色法評價(jià)MLT對心房肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，睡眠剝奪顯著增加了心肌細(xì)胞的凋亡，而MLT處理則減輕了這種作用。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明睡眠剝奪誘發(fā)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而MLT可能提供潛在的治療益處。（圖2）

圖2 褪黑素可減輕SD誘導(dǎo)的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)

3. MLT可能通過影響鈣信號傳導(dǎo)和氧化應(yīng)激來改善AF的易感性
在基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析中，利用CTD、DisGeNET、藥物庫、基因卡和OMIM等數(shù)據(jù)庫，篩選出與AF、SD和MLT相關(guān)的靶點(diǎn)。隨后，使用Cytoscape分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用置信評分閾值為0.9，得到100個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

隨后對核心靶標(biāo)進(jìn)行了富集分析。KEGG（京都基因與基因組百科全書）富集分析確定了顯著的通路，包括鈣信號通路、凋亡和PPAR信號通路，生物通路富集分析強(qiáng)調(diào)了其在鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和線粒體過程中的作用。關(guān)鍵分子功能與蛋白激酶活性和鈣通道活性相關(guān)，而細(xì)胞成分主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜相關(guān)。綜上所述，我們假設(shè)MLT可能會(huì)通過影響線粒體氧化應(yīng)激和鈣信號通路降低睡眠時(shí)對房顫的易感性。

Western blot分析表明，睡眠剝奪誘導(dǎo)了心房Ca²⁺處理蛋白的修飾，特別是RyR2在Ser2814位點(diǎn)的磷酸化水平的增加和CaMKII的氧化。與此相反，睡眠剝奪大鼠心房中SERCA和NCX的表達(dá)水平降低，而這些改變在MLT治療后被逆轉(zhuǎn)。此外，通過DHE-red染色和MDA水平的升高以及SOD的降低證明睡眠剝奪導(dǎo)致了氧化應(yīng)激的增加；而MLT能有效地緩解這些影響。這些結(jié)果表明，MLT可能通過調(diào)節(jié)鈣水平和降低氧化應(yīng)激從而降低睡眠剝奪誘發(fā)的房顫的風(fēng)險(xiǎn)。（圖3） 

圖3 褪黑素可能通過影響鈣信號傳導(dǎo)和氧化應(yīng)激來改善SD誘導(dǎo)的AF易感性

4. MLT改善了睡眠剝奪大鼠的心房鈣信號異常
應(yīng)用高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)評估Control組、SD組、SD+MLT組大鼠心房鈣信號變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MLT逆轉(zhuǎn)了SD誘導(dǎo)的CaD（鈣瞬變時(shí)程）延長。CaD的不同復(fù)極化階段揭示了Ca²⁺動(dòng)力學(xué)啟動(dòng)、釋放和衰退的連續(xù)階段。傳導(dǎo)熱圖顯示了四個(gè)位點(diǎn)在不同復(fù)極化階段的CaD。與對照組和治療組相比，睡眠剝奪促進(jìn)了CaD從CaD20延長到CaD90，并增加了CaD的空間離散性和不均勻性。值得注意的是，這種睡眠剝奪導(dǎo)致的峰值時(shí)間延遲在MLT治療后得到緩解，強(qiáng)調(diào)了其對心房Ca²⁺穩(wěn)態(tài)的有益影響。（圖4）

圖4 MLT改善了SD大鼠心房Ca²⁺處理異常

5. MLT改善了睡眠剝奪大鼠的APD（動(dòng)作電位時(shí)程）異常
與觀察到的睡眠剝奪大鼠鈣動(dòng)力學(xué)改變一致，我們的研究結(jié)果還顯示了心房APD的顯著延長，以及到峰值的激活時(shí)間的延長，同時(shí)伴隨著APD的空間離散度和變異系數(shù)的增加。值得注意的是，這些異常的電生理指標(biāo)在MLT治療后得到了顯著的改善。

6. MLT改善了睡眠剝奪大鼠的心房傳導(dǎo)特性
給予S1-S1刺激后，與對照組相比，MLT改善了SD誘導(dǎo)的APD和CaD的異位活性。此外，MLT顯著提高了睡眠剝奪大鼠的傳導(dǎo)速度，并降低了其異質(zhì)性。（圖5）

7. MLT減輕了心房CaT（鈣瞬變時(shí)程）、APD和空間上不一致的交替反應(yīng)的發(fā)生
復(fù)極化離散度和鈣瞬變信號不一致性與致心律失常相關(guān)。使用S1-S1刺激方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睡眠剝奪的大鼠比對照組表現(xiàn)出更多的心房CaT和APD交替，表明心律失常的風(fēng)險(xiǎn)更高，而MLT治療顯著緩解了這一現(xiàn)象，特別是在較短的周期長度（80和60ms），提示其對心律失常的治療潛力。

空間不一致交替（SDA）反映了心臟不均勻的復(fù)極化，通常發(fā)生在較短的周期長度。這導(dǎo)致心房區(qū)域的CaT交替振幅不同，有些區(qū)域出現(xiàn)較大的波動(dòng)，有些區(qū)域波動(dòng)較小。在睡眠剝奪的大鼠中，SDA隨著起搏間隔從100ms減少到80-60ms而增加。在這些時(shí)間間隔內(nèi)，SDA在睡眠剝奪的大鼠中比在對照組中更常見。MLT在這些關(guān)鍵時(shí)間間隔降低了SDA的發(fā)生率，表明其在減少睡眠剝奪導(dǎo)致的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)方面具有潛在的治療作用。（圖6）

圖6 MLT減輕了SD大鼠中CaT-、APD-和空間不一致交替的發(fā)生

8. MLT改善SD大鼠心房RyR不應(yīng)期
S1刺激誘發(fā)了心房肌細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺釋放。額外的S2刺激可以使下一個(gè)Ca²⁺瞬態(tài)在正常狀態(tài)下達(dá)到相當(dāng)大的振幅。當(dāng)S1脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺瞬變時(shí)，S2誘導(dǎo)的CaT與之前S1誘導(dǎo)的CaT的比值被確定為CaT不應(yīng)期，也稱為RyR2不應(yīng)期。圖中展示了S1刺激與最終S2刺激吻合后的CaT波形。熱圖顯示了四個(gè)區(qū)域的RyR2不應(yīng)期的空間差異性隨S1-S2區(qū)間遞減而加劇。這些熱圖還表明，MLT顯著減輕了睡眠剝奪大鼠的CaT恢復(fù)比率的空間異質(zhì)性。同時(shí)，與Control組相比，睡眠剝奪延長了S2間隔為60至90毫秒的CaT恢復(fù)時(shí)間，而MLT有效緩解了這一現(xiàn)象。此外，CaT恢復(fù)率的變異系數(shù)，在睡眠剝奪大鼠的心房中更高，但在MLT治療后降低，表明各區(qū)域鈣釋放恢復(fù)的均勻性增強(qiáng)。（圖7）

圖7 MLT改善SD大鼠心房RyR不應(yīng)期

9. 外源性MLT干預(yù)作用減弱了H₂O₂誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙傾向
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，MLT可能通過減輕氧化應(yīng)激和線粒體損傷來改善睡眠剝奪引起的心房重構(gòu)。先前的Western blot分析表明，在不同的研究組中，CaMKII氧化和相關(guān)的鈣處理蛋白表達(dá)水平存在顯著差異。此外，熒光標(biāo)測結(jié)果顯示，MLT糾正了大鼠睡眠剝奪模型中異常的心房Ca²⁺穩(wěn)態(tài)，這表明MLT的作用可能擴(kuò)展到減少CaMKII氧化和鈣處理正常化，從而降低睡眠剝奪誘導(dǎo)心房顫動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，我們使用特異性氧化CaMKII抑制劑KN93作為陽性對照組進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些藥物對H₂O₂引發(fā)的線粒體氧化損傷有顯著的保護(hù)作用，這可以從MitoSOX-Red和cellrox-綠色熒光的降低得到證明。此外，從JC-1聚集/單體比例的增加推斷，兩種處理均能通過下調(diào)Fis1表達(dá)抑制DRP1寡聚化和Ser616磷酸化，提高M(jìn)FN1和MFN2水平，增強(qiáng)DRP1在Ser637位點(diǎn)的磷酸化來恢復(fù)線粒體膜去極化。以上結(jié)果支持了MLT減輕HL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙的假說。（圖8）

圖8 外源性MLT干預(yù)可減輕H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙

10.  MLT抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Ca²⁺處理異常和CaMKII氧化
為了闡明MLT對CaMKII氧化翻譯后修飾和細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的影響，我們使用Fluo-4 AM探針監(jiān)測HL-1細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平。研究結(jié)果顯示，平均熒光強(qiáng)度顯著升高，表明H₂O₂刺激細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平升高。經(jīng)MLT和CaMKII氧化抑制劑KN93處理后，這種作用得到緩解。此外，使用Rhod-2熒光探針監(jiān)測到H₂O₂暴露后線粒體中Ca²⁺的積累加劇而MLT和KN93處理都有效地減弱了這種病理狀態(tài)。這表明MLT和KN93可能抑制線粒體Ca²⁺超載。隨后對鈣處理蛋白的分析顯示，過氧化氫暴露增強(qiáng)了CaMKII的氧化和激活，以及隨后的下游靶點(diǎn)-NCX和RyR2 Ser2814的磷酸化，從而下調(diào)了SERCA2α（肌漿網(wǎng) Ca²⁺再攝取的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體）的表達(dá)。值得注意的是，MLT和KN93顯著地抵消了這些變化。這提示MLT可能通過減輕氧化應(yīng)激和恢復(fù)鈣處理穩(wěn)態(tài)來降低與睡眠剝奪相關(guān)的房顫易感性。（圖9）

圖9 MLT抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Ca²⁺處理異常和CaMKII氧化

本研究提出了幾個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)：(1) MLT緩解了SD誘導(dǎo)的心房電重構(gòu)，包括AERP逆轉(zhuǎn)，降低了房顫誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間；(2) MLT減輕了SD誘導(dǎo)的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，包括心房間質(zhì)纖維化、凋亡和炎癥；(3) MLT改善在APD和CaD的改變以及傳導(dǎo)異常；(4) MLT改善致心律失常交替，增強(qiáng)心房RyR不應(yīng)性；(5) MLT抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的 Ca²⁺處理異常和CaMKII氧化。目前，這是第一個(gè)證明MLT在睡眠剝奪的情況下發(fā)揮抗心律失常作用的研究。（圖10）

圖10 MLT改善睡眠剝奪過程中房顫易感性的機(jī)制示意圖