一、引言

1.1 質(zhì)粒 DNA 與 PBMC 特性

質(zhì)粒 DNA 是雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，多存在于細(xì)菌等微生物中。它能自主復(fù)制，且易于改造，是基因工程中常用的載體。在基因治療里，可攜帶治療基因作用于靶細(xì)胞；在疫苗研發(fā)中，能編碼抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，為新型疫苗研發(fā)提供途徑。

外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞。其中 T 細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，B 細(xì)胞負(fù)責(zé)體液免疫，單核細(xì)胞在抗原呈遞等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。PBMC 在免疫反應(yīng)各階段都很重要，研究它有助于了解免疫疾病發(fā)病機(jī)制，為治療提供新策略。

1.2 構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系意義

深入研究質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染 PBMC 的轉(zhuǎn)化體系，有助于科研人員從分子層面解析 PBMC 基因功能。將特定基因?qū)��?PBMC，觀察其對(duì)細(xì)胞功能和信號(hào)通路的影響，能揭示免疫細(xì)胞調(diào)控機(jī)制，為免疫學(xué)理論發(fā)展提供依據(jù)。

成功構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化體系，有望開發(fā)基于 PBMC 基因修飾的治療手段。在癌癥治療中，導(dǎo)入免疫激活基因增強(qiáng)免疫監(jiān)視；在自身免疫病治療中，調(diào)節(jié) PBMC 基因表達(dá)糾正免疫失衡，為疑難病癥治療帶來希望。

二、材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

采集健康志愿者外周血，確保志愿者采血前兩周未用免疫調(diào)節(jié)藥物，采集后盡快送實(shí)驗(yàn)室用于 PBMC 分離。

實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒 DNA 含綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因，由實(shí)驗(yàn)室通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建并保存。構(gòu)建時(shí)優(yōu)化了啟動(dòng)子等元件，保障目的基因高效表達(dá)。

準(zhǔn)備特定電轉(zhuǎn)染緩沖液，維持細(xì)胞生理狀態(tài)；準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和抗生素，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、提供生長(zhǎng)因子并防止污染。

選用某品牌電穿孔儀，可精準(zhǔn)調(diào)節(jié)電壓等參數(shù)；用離心機(jī)分離細(xì)胞和核酸；用二氧化碳培養(yǎng)箱控制培養(yǎng)條件；用熒光顯微鏡觀察 GFP 表達(dá)。

2.2 實(shí)驗(yàn)具體方法

將外周血與等量生理鹽水混合，鋪在淋巴細(xì)胞分離液上離心，收集中間層 PBMC。用含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液。

采用堿裂解法提取純化質(zhì)粒 DNA。先培養(yǎng)含質(zhì)粒的細(xì)菌，收集后堿裂解釋放質(zhì)粒 DNA，再用酚 - 氯仿抽提、乙醇沉淀獲得純化產(chǎn)物，最后檢測(cè)純度和濃度。

將適量 PBMC 與質(zhì)粒 DNA 在電轉(zhuǎn)染緩沖液中混勻，轉(zhuǎn)移到電穿孔杯，設(shè)置不同電穿孔參數(shù)，如電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)移細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染后 24 - 48 小時(shí)，用熒光顯微鏡觀察 GFP 表達(dá)，統(tǒng)計(jì)熒光細(xì)胞比例估算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)定量分析，收集細(xì)胞洗滌后上機(jī)檢測(cè)，通過軟件得出準(zhǔn)確數(shù)值。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 電穿孔參數(shù)影響

電壓從 100V 升高，轉(zhuǎn)染效率上升，200V 時(shí)達(dá)峰值約 [X]%。超過 220V，轉(zhuǎn)染效率下降，細(xì)胞死亡率增加。說明適當(dāng)提高電壓利于質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入細(xì)胞，但過高會(huì)損傷細(xì)胞膜。

脈沖寬度從 10ms 增加到 30ms，轉(zhuǎn)染效率提高。繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)染效率上升不明顯，細(xì)胞死亡率劇增。表明較長(zhǎng)脈沖寬度增加質(zhì)粒進(jìn)入機(jī)會(huì)，但也增加細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)。

脈沖次數(shù)從 1 次增加到 3 次，轉(zhuǎn)染效率逐步提高。增加到 4 次和 5 次，轉(zhuǎn)染效率提升不明顯，細(xì)胞死亡率顯著增加。說明適量增加脈沖次數(shù)可提高轉(zhuǎn)染效率，但過多會(huì)過度損傷細(xì)胞。

綜合優(yōu)化后，確定最佳參數(shù)為電壓 200V、脈沖寬度 30ms、脈沖次數(shù) 3 次，此時(shí)轉(zhuǎn)染效率可達(dá) [X]%。

3.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)電穿孔處理后 PBMC 的活力。在最佳參數(shù)下，經(jīng)染色后顯微鏡觀察，細(xì)胞活力保持在 [X]% 以上。說明該條件下電穿孔對(duì)細(xì)胞損傷小，利于后續(xù)研究。

3.3 GFP 表達(dá)情況

熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后的 PBMC 中有大量細(xì)胞發(fā)綠色熒光，表明質(zhì)粒 DNA 成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)。隨機(jī)視野中熒光細(xì)胞分布均勻。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果與顯微鏡觀察一致，準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)染情況。

四、討論分析

4.1 電穿孔因素剖析

電壓是影響轉(zhuǎn)染效率的核心因素。適當(dāng)提高電壓可使細(xì)胞膜形成可逆小孔，利于質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入。但超過閾值，細(xì)胞膜損傷不可修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，所以找到電壓平衡點(diǎn)很關(guān)鍵。

脈沖寬度決定電場(chǎng)作用時(shí)間，較長(zhǎng)時(shí)間使質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入機(jī)會(huì)增加，但細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)也增大。脈沖次數(shù)影響電場(chǎng)累積效應(yīng)，適量增加可提高轉(zhuǎn)染效率，過多則會(huì)損傷細(xì)胞。優(yōu)化參數(shù)時(shí)需綜合考慮二者對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力的影響。

4.2 研究策略評(píng)估

本研究用 GFP 報(bào)告基因評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，直觀簡(jiǎn)便。通過熒光顯微鏡初判，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，全面考察各因素，為建立高效轉(zhuǎn)染方法提供有力支持。

本研究?jī)H針對(duì)含 GFP 報(bào)告基因的一種質(zhì)粒 DNA 在 PBMC 中的轉(zhuǎn)染。不同質(zhì)粒 DNA 因結(jié)構(gòu)等不同，轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性可能有差異。且實(shí)驗(yàn)僅用健康人 PBMC，疾病狀態(tài)下 PBMC 特性可能改變，轉(zhuǎn)染特性也不同。所以研究結(jié)果臨床應(yīng)用受限，需進(jìn)一步研究。

4.3 創(chuàng)新應(yīng)用前景

本研究創(chuàng)新在于系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，建立高效低毒轉(zhuǎn)染方法。全面考察關(guān)鍵因素確定最佳組合，提高轉(zhuǎn)染效率同時(shí)降低細(xì)胞損傷，為 PBMC 基因研究和細(xì)胞免疫治療提供技術(shù)支撐。

基于研究成果，在基因治療領(lǐng)域前景廣闊�？蓪�(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)基因用于癌癥免疫治療，或轉(zhuǎn)染糾正基因缺陷的質(zhì)粒 DNA 治療遺傳性免疫缺陷病。本研究方法也可為其他相關(guān)領(lǐng)域研究提供借鑒。

五、研究結(jié)論

本研究系統(tǒng)探究了質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染 PBMC 的電穿孔因素，明確了電壓、脈沖寬度和脈沖次數(shù)等參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力的影響。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，成功建立高效低毒電穿孔轉(zhuǎn)染方法，在最佳條件下實(shí)現(xiàn)較高轉(zhuǎn)染效率和較好細(xì)胞活力。為 PBMC 基因研究和細(xì)胞免疫治療奠定基礎(chǔ)，但存在局限性，后續(xù)需拓展研究完善技術(shù)。