本文來源于：生物制品圈 本文原創(chuàng)為：干細(xì)胞者說

類器官技術(shù)始于2009年，荷蘭Hubrecht研究所的 Hans Clevers 團(tuán)隊成功的將成體干細(xì)胞培養(yǎng)成為小腸的隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)。

類器官 VS 組織樣本 VS 動物模型

目 錄
一、類器官的概念
二、類器官的發(fā)展歷史
三、類器官的培養(yǎng)
四、類器官的應(yīng)用
五、類器官的產(chǎn)業(yè)鏈
六、類器官的市場格局
七、類器官的挑戰(zhàn)
八、類器官的未來發(fā)展

-01-類器官的概念

類器官（Organoids）指利用成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞進(jìn)行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官，但能在結(jié)構(gòu)和功能上模擬真實器官，能夠最大程度地模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及功能并能夠長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

目前類器官分為兩類：組織來源類器官和多能干細(xì)胞來源類器官。

相比傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模型，類器官代表著一種能夠概括整個生物體生理過程的創(chuàng)新技術(shù)，具有更接近生理細(xì)胞組成和行為、更穩(wěn)定的基因組、更適合于生物轉(zhuǎn)染和高通量篩選等優(yōu)勢。而與動物模型相比，類器官模型的操作更簡單，還能用于研究疾病發(fā)生和發(fā)展等機理，因而在器官發(fā)育、精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、基因編輯、疾病建模等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。2013年，類器官被《科學(xué)》雜志評為年度十大技術(shù)。2018年初，類器官被評《自然·方法》評為2017年度方法。

在Pubmed上搜索 “類器官” 這一詞條，類器官相關(guān)文章從2010年的42篇，在短短十年間，躍升到2020年的2097篇。類器官以極迅猛的態(tài)勢成為研究熱點。

-02-類器官的發(fā)展歷史

類器官的起源可以追溯到1907年，當(dāng)時44歲的美國貝克羅萊那大學(xué)教授威爾遜 (H. V. Wilson)發(fā)現(xiàn)通過機械分離的海綿 (sponge) 細(xì)胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的海綿有機體，他的研究結(jié)果于1910年發(fā)表。威爾遜的研究證明了成年的有機體在無需外界幫助、無需從特定的解剖學(xué)階段開始，也具有完整的信息并可以成功發(fā)育成新的有機體。

對類器官技術(shù)而言，另外一個十分關(guān)鍵的契機是干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。干細(xì)胞想必大家并不陌生，很多人對于干細(xì)胞的第一印象都是來源于媒體中對于血液疾病造血干細(xì)胞移植療法的介紹。近年來火熱的干細(xì)胞研究，主要開始于上世紀(jì)末。1987年，A. J. Friedenstein發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal Stem Cell, MSCs)。 1998年，美國生物學(xué)家James Thomson首次分離得到人胚胎干細(xì)胞。2007年，山中伸彌教授成功制造出人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem Cells, iPSC)。如今，絕大多數(shù)類型的非腫瘤來源的人源類器官均可由MSCs或iPSC發(fā)育而來，干細(xì)胞研究的飛速進(jìn)展為類器官研究帶來新的活力。

類器官發(fā)展主要事件

數(shù)據(jù)來源：Am J Physiol Cell Physiol雜志

當(dāng)代類器官的發(fā)展成果，主要集中在近十余年。

• 2007年，Hans Clevers 的實驗室通過 lineage tracing 驗發(fā)現(xiàn)小腸和結(jié)腸的干細(xì)胞為 Lgr5+細(xì)胞。
• 2009年，Hans Clevers實驗室使用單個鼠LGR5+腸干細(xì)胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸類器官。
• 2011年，由人多能干細(xì)胞和原代成體干細(xì)胞發(fā)育而來的腸類器官被成功制作。同年，由鼠胚胎干細(xì)胞培育而來的視網(wǎng)膜類器官被首次成功培育。
• 2012年，由人多能干細(xì)胞發(fā)育而來的視網(wǎng)膜類器官成功培育。
• 2013年，由人多能干細(xì)胞發(fā)育而來的腦類器官被成功培育。肝、腎、胰類器官被成功培育。
• 2014年，前列腺、肺類器官被成功培育。
• 2015年，乳腺、輸卵管、海馬體類器官被成功培育。
• 2020年，蛇毒液腺類器官被成功培育。

類器官的研究熱點是病人來源的類器官 (Patient-Derived Organoids, PDOs)，因為通常用于腫瘤患者的疾病建模、研究與藥物篩選，常常被稱為腫瘤類器官。腫瘤類器官的發(fā)展開始于2013年，自此之后呈逐年上升趨勢。腫瘤類器官是指將患者活檢、穿刺或手術(shù)切除組織在基質(zhì)膠中培養(yǎng)數(shù)周得到的類器官。腫瘤類器官在高度保持源腫瘤的異質(zhì)性和患者之間的異質(zhì)性的同時，類器官個體間形態(tài)、尺度保持基本均一，為腫瘤發(fā)病機理研究、藥物篩選、個性化精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供了快速、優(yōu)良的技術(shù)平臺。

目前3D類器官培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成功培養(yǎng)出大量具有部分關(guān)鍵生理結(jié)構(gòu)和功能的類組織器官，比如：腎、肝、肺、腸、腦、前列腺、胰腺和視網(wǎng)膜等。

-03-類器官的培養(yǎng)

類器官的培養(yǎng)可以利用體細(xì)胞、成體干細(xì)胞（包括祖細(xì)胞）或多能干細(xì)胞。2009年，腸道器官模擬技術(shù)率先取得突破，研究人員發(fā)現(xiàn)，成人腸道干細(xì)胞可以在體外增殖和自發(fā)組織化。其特征是能夠表達(dá)LGR5，這是一種編碼Wnt激動劑R-spondin受體的基因，同時需要特定的分子圍繞在旁（如Wnt、KGF和noggin）。以此為理論基礎(chǔ)，研究人員開發(fā)了一種三維培養(yǎng)體系，能夠在體外重建腸道干細(xì)胞的適宜環(huán)境，并從腸道上皮細(xì)胞或單個LGR5+干細(xì)胞分化出具有自我更新能力、保持腸道腺窩絨毛狀結(jié)構(gòu)的類器官。該模型可以持續(xù)擴增達(dá)3個月，穩(wěn)定的基因組保證了純化和生產(chǎn)放大等優(yōu)勢，此后這種方法被用于從其它主要器官上皮組織培養(yǎng)各種類器官。

成人干細(xì)胞衍生的類器官培養(yǎng)，通常是通過將分離的成人干細(xì)胞或所需器官培養(yǎng)的單細(xì)胞懸浮液，嵌入到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）水凝膠中來建立的。例如腸道器官，從小腸或結(jié)腸分離出的隱窩細(xì)胞足以培養(yǎng)出類器官，也可以從分離的成人腸干細(xì)胞中培養(yǎng)出類器官。

上皮類器官培養(yǎng)基是以附加與器官相關(guān)的生長因子的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的。因此，從其他組織（如呼吸道、肝臟、胰腺、皮膚、膀胱、大腦、心臟）提取的細(xì)胞器要求在培養(yǎng)中補充相關(guān)生長因子。例如大腦類器官培養(yǎng)過程如下圖：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生細(xì)胞在神經(jīng)誘導(dǎo)介質(zhì)中生長，產(chǎn)生神經(jīng)外胚層，嵌入Matrigel中，并在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或軌道搖床中生長，以更好地擴散，獲得三維腦器官。在暴露于維甲酸的情況下，大腦器官通過自我組裝模式，形成自締和組織，形成包括放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的不同種群的神經(jīng)祖細(xì)胞，這些神經(jīng)祖細(xì)胞擴展形成大腦結(jié)構(gòu)。

除了成體干細(xì)胞，多能干細(xì)胞（包括誘導(dǎo)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞）也可以利用其自我更新及分化能力來制備類器官。由于從多能干細(xì)胞中提取的類器官是通過同質(zhì)群體定向分化而形成的，因此，必須在一個喚醒胚胎發(fā)生的動態(tài)過程中重新創(chuàng)造組織特異性細(xì)胞類型及其微環(huán)境。因此，多能干細(xì)胞類器官培養(yǎng)必須在分化過程中提供合適的生態(tài)位信號。由于這一過程較復(fù)雜，多能干細(xì)胞類器官往往含有不同于模型器官的細(xì)胞類型，使靶組織的信號環(huán)境和自組織復(fù)雜化。

1、科學(xué)研究中的類器官培養(yǎng)

1.1 上皮類器官研究上皮細(xì)胞-免疫細(xì)胞相互作用

上皮細(xì)胞出現(xiàn)在機體所有和外界接觸的邊界，比如皮膚，呼吸道，肺，消化道，是機體對抗病原體侵染的第一層屏障，也是第一個對病原性感染作出反應(yīng)的細(xì)胞。為了維持體內(nèi)平衡，并提供對感染的快速反應(yīng)，上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞密切配合。所以在上皮區(qū)域，也是全身免疫細(xì)胞濃度最高的區(qū)域。建立上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的模型，是研究抗感染免疫和損傷后免疫的重要手段。上皮細(xì)胞類器官的建立，可以非常精準(zhǔn)的模擬機體上皮環(huán)境，也被發(fā)展起來研究上皮和免疫細(xì)胞相互作用。

有三種共培養(yǎng)的模式

1.用存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的重組細(xì)胞因子處理類器官，評價免疫細(xì)胞衍生細(xì)胞因子對于上皮細(xì)胞的影響。如IL-4和IL-13促進(jìn)叢生細(xì)胞分化，而IL-22支持干細(xì)胞增殖和存活。

2.將器官消化到單個細(xì)胞，然后在免疫細(xì)胞存在的情況下，再生長。用于評估免疫細(xì)胞和免疫細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子（可溶性或膜結(jié)合）對器官生長和分化的影響，以及上皮細(xì)胞對免疫細(xì)胞表型的影響。

3.在ECM或生長培養(yǎng)基（懸浮培養(yǎng)）中，向完整的類器官中添加（活化的）免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞或固有淋巴樣細(xì)胞（ILCs），以評估免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的相互作用。這些檢測的讀數(shù)通常包含消化形成的器官和隨后的轉(zhuǎn)錄。單細(xì)胞RNA測序或定量PCR（QPCR），成像和/或流式細(xì)胞術(shù)評估上皮細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞表型。在這些共培養(yǎng)中使用的免疫細(xì)胞要么直接從小鼠組織（例如，脾細(xì)胞、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層T細(xì)胞、固有層ILCs或肺ILC2s）中分類，要么直接從人外周血中提取，要么先在體外分化。

1.2 胸腺類器官研究T細(xì)胞發(fā)育

胸腺是T細(xì)胞成熟和從祖細(xì)胞向成熟的幼稚淋巴細(xì)胞分化的中心部位。來源于骨髓的T細(xì)胞祖細(xì)胞在胸腺皮質(zhì)進(jìn)行陽性選擇，隨后在胸腺髓質(zhì)中進(jìn)行陰性選擇。胸腺的這些區(qū)域由兩種不同的上皮細(xì)胞組成：皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞（CTECs）和髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞（MTECs）。3D重建胸腺被證明是模擬其功能的關(guān)鍵，幾種胸腺類器官的產(chǎn)生方法：這些器官培養(yǎng)通常是從人類身上建立起來的或胎鼠或新生兒胸腺組織，但也有報道稱TEC樣細(xì)胞與人胚胎干細(xì)胞的體外分化，這些培養(yǎng)都產(chǎn)生胸腺樣結(jié)構(gòu)。在體外產(chǎn)生活的T細(xì)胞，并在移植到裸鼠上時發(fā)揮作用。有趣的是，雖然長時間的類似胸腺的培養(yǎng)是可能的（離體培養(yǎng)長達(dá)56天），但細(xì)胞在連續(xù)傳代時失去了集落形成能力。重要的是，雖然在成年小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種雙能的TEC前體，但含cTECs和mTECs的胸腺器官尚未從單個干細(xì)胞中生成。此外，考慮到小鼠體內(nèi)某些雙能TEC前體的生長因子已被發(fā)現(xiàn)（例如BMP 4和IL-22），可以嘗試這些因子是否可用于維持TEC的祖細(xì)胞來源的類器官。

2、腫瘤微環(huán)境

兩種主要的方式被使用（以非小細(xì)胞肺癌為例）

在整體方法（左）中，腫瘤活檢組織是在氣液界面間環(huán)境培養(yǎng)，所有腫瘤細(xì)胞類型的細(xì)胞懸液，包括內(nèi)源性免疫細(xì)胞和其他非上皮細(xì)胞類型，促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞的生長。

在還原模擬方法（右）中，上皮類器官是從腫瘤活檢組織中生長出來的，然后與來自同一患者外周血的自體免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)細(xì)胞的連續(xù)擴張。

雖然整體方法允許包括整個腫瘤微環(huán)境的腫瘤材料的培養(yǎng)，因此與體內(nèi)情況非常相似，但不易長時間維持，而還原模擬方法允許腫瘤上皮的長期培養(yǎng)和擴展，這使得更廣泛，更長期的研究成為可能。

3、藥物篩選

3.1 促進(jìn)心肌纖維細(xì)胞生長化合物篩選

動物模型，主要是老鼠，被廣泛用于研究心臟病，提供有價值的結(jié)果。然而，由于許多功能和生物學(xué)特性的物種差異很大，它們對人類心臟疾病和藥物安全性的推斷很差。人類多能干細(xì)胞（hPSC）可以為生物醫(yī)學(xué)和藥物研究提供無限的人類心肌細(xì)胞來源，有可能彌合這一鴻溝。然而，傳統(tǒng)2D培養(yǎng)中的hPSC源性心肌細(xì)胞缺乏功能成熟，，這在某些情況下阻礙了它們準(zhǔn)確預(yù)測人類生物學(xué)和病理生理學(xué)的能力。多細(xì)胞3D人體類器官提供了更精確的模型，是解決這一問題的潛在方法。澳大利亞昆士蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系的科學(xué)家在Cell Stem Cell發(fā)表文章，闡述他們基于96孔板，培養(yǎng)心臟心肌類器官，進(jìn)而進(jìn)行化合物篩選的新流程。

具體流程如下圖：

基于類器官，將5000種化合物，篩選出不同功能化合物。

3.2 特定神經(jīng)類器官培養(yǎng)及藥物篩選等應(yīng)用

首先神經(jīng)球在不同分化培養(yǎng)基種培養(yǎng)（具體的誘導(dǎo)因子及生長因子見下圖），產(chǎn)生大腦，中腦，海馬，前腦等不同腦部類器官。

（資料來源：干細(xì)胞者說）

-04-類器官的應(yīng)用

類器官作為一個新興的技術(shù)，在科學(xué)研究領(lǐng)域潛力巨大，包括發(fā)育生物學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、再生機制、精準(zhǔn)醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗。類器官培養(yǎng)使研究人體發(fā)育提供了不受倫理限制的平臺，為藥物篩選提供了新的平臺，也是對現(xiàn)有2D培養(yǎng)方法和動物模型系統(tǒng)的高信息量的互補 。此外，類器官為獲取更接近自然人體發(fā)育細(xì)胞用于細(xì)胞治療成為可能。

通過類器官繁殖的干細(xì)胞群取代受損或者患病的組織，類器官提供自體和同種異體細(xì)胞療法的可行性，未來這一技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也擁有巨大的潛力。使用這項技術(shù)，采用CRISPR/Cas9能夠糾正體外遺傳異常并能夠?qū)⒔】档霓D(zhuǎn)基因細(xì)胞再次回輸入患者體內(nèi)，并在后期整合入組織內(nèi)。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，患者衍生的類器官也被證明為有價值的診斷工具。在進(jìn)行治療之前，采用從患者樣本來源的類器官篩查患者體外藥物反應(yīng)，旨在為癌癥和囊胞性纖維癥患者的護(hù)理提供指導(dǎo)并預(yù)測治療結(jié)果。隨著類器官培養(yǎng)系統(tǒng)以及其實驗開發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展，類器官應(yīng)用到了各大研究領(lǐng)域。

1、通過類器官對發(fā)育和疾病進(jìn)行建模

研究人員可以通過類器官來模擬人類發(fā)育和疾病，因為類器官是從人類干細(xì)胞或成年細(xì)胞產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞生長而來的，它們的成分和結(jié)構(gòu)也與原發(fā)組織相似，并且易于操作和冷凍保存。這意味著類器官可以用于研究源自干細(xì)胞的人體組織且難以通過動物模型模擬的人類疾病分析，研究人員僅需少量的起始物質(zhì)即可培養(yǎng)類器官。

因其與對應(yīng)的器官擁有類似的空間組織、保持一些關(guān)鍵特性并能夠重現(xiàn)部分生理功能，而被認(rèn)為是檢測人類生物學(xué)和疾病方面的新模型。相較于細(xì)胞系、基因工程鼠和人源化異種移植鼠（patient-derived xenografts, PDX）這些傳統(tǒng)的研究模型，類器官模型（鼠源類器官mouse-derived organoids, MDO和人源類器官patient-derived organoids, PDO）不但能夠取自正常組織和組織癌變過程中各個階段的腫瘤組織，而且其培養(yǎng)體系簡單易操作，時間和金錢成本較低，且具有較高效率，因而得到廣大研究人員的親賴，被Nature Methods評為2017年生命科學(xué)領(lǐng)域年度技術(shù)。

主要研究模型對比

數(shù)據(jù)來源：Science雜志

目前，類器官多用于腫瘤癌癥的研究中。觀察下圖中臨床前腫瘤癌癥模型的比較，可以發(fā)現(xiàn)類器官有著很強的優(yōu)勢：

目前，癌癥聯(lián)盟組織如國際癌癥基因組聯(lián)盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）、癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas， TCGA）所使用的大部分樣本都取自于原發(fā)腫瘤（primary tumors）。相比之下，PDO可以取自腫瘤發(fā)展過程中的任何階段，而且只需要一小部分腫瘤組織即可在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴增。研究人員已經(jīng)在肝癌、胰腺癌和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中，通過穿刺獲得活檢，成功的在體外進(jìn)行類器官培養(yǎng)。甚至能夠?qū)⑶傲邢侔┗颊叩难�環(huán)腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)成類器官。也有研究人員從尿路（urine）和支氣管肺泡（bronchial lavage）的正常細(xì)胞中成功培養(yǎng)類器官，但是目前還不清楚這些培養(yǎng)方法能否適用于這些組織來源的腫瘤類器官培養(yǎng)。

2、干細(xì)胞類器官工程

干細(xì)胞生物工程技術(shù)的進(jìn)步提高了控制細(xì)胞類型，組織和相互作用的能力，而類器官工程正需要通過直接修飾干細(xì)胞或控制微環(huán)境來操縱每個結(jié)構(gòu)層。現(xiàn)在，科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了更精確的合成環(huán)境，通過用信號蛋白修飾基質(zhì)的生物惰性區(qū)域，可以更好地控制干細(xì)胞的活性。類器官工程技術(shù)對于一些體內(nèi)環(huán)境成分復(fù)雜、需要精確建模的發(fā)育研究特別有用。

3、類器官與精準(zhǔn)醫(yī)療

類器官技術(shù)正在成為個體化治療的工具，運用類器官技術(shù)進(jìn)行個體化治療是指，通過體外對類器官進(jìn)行藥物篩選和基因型分析，制定適合這個個體的治療藥物和方法。截至到目前，不同腫瘤PDOs對傳統(tǒng)和正在研發(fā)的藥物所產(chǎn)生的反應(yīng)是各種各樣的。對目前有限的資源研究發(fā)現(xiàn)，大部分PDOs所展現(xiàn)的治療反應(yīng)和相對應(yīng)的病人剛開始對治療的反應(yīng)是一致的。PDOs也可以用于針對被動或獲得性耐受開發(fā)新的藥物。更重要的是，PDOs對具有細(xì)胞毒性的藥物敏感性較強，因而可以更好的預(yù)測病人使用后的臨床反應(yīng)。接下來，研究人員對大量個體PDOs的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，找出共同特征，進(jìn)而對一類相似病人進(jìn)行生物標(biāo)記物開發(fā)研究。

3.1藥物篩選

類器官培養(yǎng)物可用于藥物篩選，這可將腫瘤的遺傳背景與藥物反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。來自同一患者健康組織的類器官的建立提供了通過篩選選擇性殺死腫瘤細(xì)胞而又不損害健康細(xì)胞的化合物來開發(fā)毒性較小的藥物的機會。自我更新的肝細(xì)胞類器官培養(yǎng)物可用于測試潛在新藥的肝毒性（臨床試驗中藥物失敗的原因之一）。

藥物篩選模型對比

3.1.1 類器官藥物篩選的優(yōu)勢

速度快：類器官構(gòu)建成功率高以及培養(yǎng)速度快。常規(guī)來說，在類器官培養(yǎng)一周之后就可以進(jìn)行藥篩。從樣本采集到出具藥敏結(jié)果的全流程已經(jīng)可以很好地控制在2周之內(nèi)。

通量高：從可篩查的藥物通量來說，利用類器官不僅可以在孔板上進(jìn)行多種藥物的篩查，每個藥物還可以測試不同的濃度，多個實驗平行開展。

臨床相關(guān)性強：類器官用于癌癥藥篩的臨床相關(guān)性和預(yù)測有效性在多篇研究中都已經(jīng)得到了較為充分的證實。Vlachogiannis G團(tuán)隊在Science發(fā)表了腫瘤類器官體外藥敏測試指導(dǎo)臨床用藥的里程碑式研究，在71位轉(zhuǎn)移性胃腸道癌提取了110份組織構(gòu)建了類器官，共測試了55種抗癌藥物。研究結(jié)果顯示，類器官藥篩達(dá)到了93%的特異性，100%的靈敏度、88%的陽性預(yù)測率和100%的陰性預(yù)測率，展現(xiàn)了極高的臨床相關(guān)性。

3.1.2 類器官進(jìn)行藥篩的流程

藥物篩選流程包括類器官的構(gòu)建、評估、藥敏檢測三大方面：

類器官構(gòu)建：類器官的樣本來源通常為腫瘤組織或者胸腹水等惡性積液，主流的培養(yǎng)方法包括較為常用的正置膠滴法、適用于腫瘤和睪丸類器官培養(yǎng)的倒置膠滴法、適用于有氣體接觸的黏膜類器官（腸、呼吸道）培養(yǎng)的氣液界面法以及需要較大擴增（腦類器官）的生物反應(yīng)器法等。首先將患者來源的腫瘤樣本組織通過機械剪切得到腫瘤細(xì)胞團(tuán)，再將細(xì)胞團(tuán)酶消化成單細(xì)胞。分離消化后，將細(xì)胞嵌入到基質(zhì)膠中并在96/384孔板上進(jìn)行膠滴的種接，再覆蓋以培養(yǎng)基和細(xì)胞因子培養(yǎng)。類器官培養(yǎng)至直徑幾百微米的細(xì)胞小球即可用于藥篩。類器官培養(yǎng)特有的重要試劑包括消化液、培養(yǎng)基（例如Wnt、R-Spondin、Noggin等細(xì)胞因子）、基質(zhì)膠（Matrigel等）。

類器官評估：在培養(yǎng)好類器官之后，對于類器官的評估和驗證也至關(guān)重要。通過基因測序、免疫熒光、HE染色等方法，從形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)以及分子遺傳學(xué)等多個維度對類器官進(jìn)行鑒定。評估的目的是確定類器官和原腫瘤具有一致性，這也是進(jìn)行后續(xù)藥篩的前提。

藥物檢測：類器官目前可篩選的藥物種類包括化療藥、小分子靶向藥、抗體藥物等。藥篩的核心檢測檢測指標(biāo)通常為IC50以及細(xì)胞抑制率，根據(jù)這些指標(biāo)在篩查的藥物中選取對腫瘤抑制效果最佳的藥物。在中國的注冊臨床中，類器官以化療藥的敏感性檢測作為主流應(yīng)用，類器官用于檢測靶向藥和免疫治療的敏感性在未來還有極大的發(fā)揮空間和應(yīng)用潛力。

3.1.3 類器官藥篩的發(fā)展方向

類器官藥篩與二代測序作為組合產(chǎn)品使用，二者在臨床上可以有機結(jié)合，很好地相輔相成。二代測序從基因?qū)用嫔蠙z測出患者的靶點突變情況和潛在的藥物敏感靶點，為醫(yī)生和患者提供初步用藥選擇，但是單憑二代測序結(jié)果無法保證完全的臨床療效。部分研究報道和臨床案例指出，二代測序篩出的潛在靶向藥并沒有在實際臨床上反應(yīng)出有效性，這一部分的不確定性通過類器官可以很好排查。

3.2 基因型分析

來自不同健康器官的類器官的生長，然后對培養(yǎng)物進(jìn)行全基因組測序，可以分析器官特異性突變譜。通過生長來自同一腫瘤不同區(qū)域的類器官，可以用于研究腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。區(qū)域特異性突變譜可以通過類器官的全基因組測序來揭示。使用與上述相似的方法，可以利用類器官來研究特定化合物對健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞突變譜的影響。

癌癥是由致病基因突變的逐漸積累引起的。因此，了解在組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生過程中活躍的突變過程是很重要的。（資料來源：中君亞泰、干細(xì)胞者說）

-05-類器官產(chǎn)業(yè)鏈

類器官行業(yè)的上游公司主要集中在為3D細(xì)胞培養(yǎng)提供試劑和材料原料，包括提供細(xì)胞支架材料、胞外基質(zhì)、細(xì)胞生長因子、培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器等。其中有比較老牌的試劑廠商ThermoFisher，Sigma-Aldrich（現(xiàn)被Merck收購），也有一批取得較大成就的創(chuàng)業(yè)型公司。包括瑞士的提供無支架三維細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的InSphero公司，加拿大最大的生物科技公司STEMCELL Technologies提供專業(yè)的細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞分選產(chǎn)品，和提供體內(nèi)微環(huán)境模擬系統(tǒng)的美國公司Xcell Biosciences等。

主要的3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

根據(jù)Meticulous Research Analysis的資料顯示：2016年，3D組織培養(yǎng)在全球細(xì)胞分析檢測市場占據(jù)了約9.3%的份額。2017年市場價值8.181億美元，在預(yù)計期內(nèi)將以8.7%的年復(fù)合增長率增長，2022年達(dá)到12.426億美元。其中，美國在全球3D細(xì)胞市場貢獻(xiàn)了約34.8%的主要份額，位居全球首位。2016年，中國在全球3D細(xì)胞市場占5%的份額，遠(yuǎn)不及美國，但預(yù)計未來五年中國將以11.8%的年復(fù)合增長率增長，成為年復(fù)合增長率最高的國家，具備市場發(fā)展?jié)摿Α?/p>

類器官行業(yè)的中下游公司營收點主要在于給各大新藥測試公司提供藥物體外試驗方案和疾病模型，即臨床試驗外包服務(wù)。例如哈佛大學(xué)Wyss生物工程學(xué)院2013年成立的生物技術(shù)公司Emulate，Emulate和FDA將合作，評估和鑒定使用Emulate的“器官芯片（Organs-on-Chips）”技術(shù)作為毒理學(xué)測試的平臺的可能性，并先后宣稱與阿斯利康和羅氏形成戰(zhàn)略合作；荷蘭生物技術(shù)公司 Mimetas研發(fā)了一種芯片腎，并與幾家制藥公司達(dá)成了應(yīng)用合作協(xié)議將其用于藥物篩選；上市公司Organovo宣稱研發(fā)出第一臺生物器官的3D打印機，開發(fā)出人造肝﹑人造腎。并于2017年10月宣布與Viscient Biosciences達(dá)成合作，以進(jìn)一步研究肝病。

類器官行業(yè)尚未在國內(nèi)形成集中化產(chǎn)業(yè)集群。除了傳統(tǒng)的國外細(xì)胞培養(yǎng)試劑和原料代理商外，中下游的公司較為稀疏。在北京、上海和廣州區(qū)域先后涌出了幾家創(chuàng)業(yè)型公司。

類器官行業(yè)在歐洲國家發(fā)展較為迅速，這和歐洲類器官科研最早起步以及積累最多必不可分。類器官的領(lǐng)頭人Hans Clevers成立的Hubrecht Organoid Technology（HUB）是類器官最早的研發(fā)中心，HUB技術(shù)授權(quán)促進(jìn)了Epistem、Cellesce、Crown Biosciences、STEMCELL Technologies在內(nèi)的一批類器官公司的涌現(xiàn)。中國在類器官領(lǐng)域中，近年來其實也呈現(xiàn)出科研數(shù)量大幅度上升的趨勢，尤其在2019-2020年這兩年間顯現(xiàn)出了強勁的發(fā)展勢頭，發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)量在全球的排名從第六位（2009-2019年）躍至第二位（2020年），僅次于美國。參考?xì)W洲的類器官發(fā)展模式，可以預(yù)計中國基礎(chǔ)科研積累的提升將加速類器官產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，在不遠(yuǎn)的將來我們也將看到更多類器官公司的涌現(xiàn)。

-06-類器官的市場競爭

在全球范圍內(nèi)類器官已經(jīng)顯示出其強大的發(fā)展?jié)摿�，國外已�?jīng)形成一定的市場競爭格局，多家公司正在快速的發(fā)展，例如AIVITA Biomedical、System1 Biosciences、JangoBio等。但國內(nèi)還未真正形成競爭市場。

國內(nèi)外部分類器官公司

數(shù)據(jù)來源：中君亞泰根據(jù)公開資料整理

-07-類器官的挑戰(zhàn)

類器官培養(yǎng)技術(shù)目前正處于技術(shù)爆發(fā)和科研成果井噴的階段，行業(yè)發(fā)展具有很大的前景，但也面臨較大的挑戰(zhàn)。比如如何利用好人體胚胎的干細(xì)胞建立持久穩(wěn)定的體外模型；培養(yǎng)條件和環(huán)境刺激如何更真實的模擬還原人體微環(huán)境；科研屬性的產(chǎn)品如何實現(xiàn)量產(chǎn)，如何轉(zhuǎn)化為臨床產(chǎn)品等。

類器官作為新型的藥篩模型，成本雖然較PDX更低，但還是遠(yuǎn)高于細(xì)胞系。類器官成本占比較高的包括培養(yǎng)使用的基質(zhì)膠，常用的基質(zhì)膠為美國BD Biosciences公司的Matrigel®，在行業(yè)內(nèi)處于較為壟斷的地位，價格較高。Matrigel可以產(chǎn)生類似于哺乳動物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料，幫助多種類型的細(xì)胞達(dá)到附著和分化。Matrigel的來源是小鼠肉瘤細(xì)胞系，除了成本較高的問題，同時批次間存在一定的變異性。且由于是動物來源，對于有機類的藥物的檢測有局限性�？紤]到小鼠來源的細(xì)胞外基質(zhì)對于藥物篩選實驗結(jié)果存在一定的干擾，因此基質(zhì)的工程技術(shù)開發(fā)用于合成外源差異較小的、非動物來源的基質(zhì)膠用于成本下降和性能優(yōu)化將是類器官產(chǎn)業(yè)化需要解決的關(guān)鍵性問題之一。基質(zhì)膠以外，培養(yǎng)也涉及多種細(xì)胞因子組合使用，細(xì)胞生長因子通常也價格不菲。選擇效果更好的細(xì)胞因子以及嘗試減少使用細(xì)胞因子的數(shù)量也可以帶來成本下降的空間。

目前大多類器官本身并不具備血管化的結(jié)構(gòu)。因此，隨著類器官體積的增長，類器官受限于氧氣的缺失以及代謝廢物的增加，可能導(dǎo)致的組織壞死。已有研究構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境的腫瘤類器官，將類器官腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上共同培養(yǎng)，生成血管結(jié)構(gòu)以期解決類器官血管化缺失的問題。

血管化以外的難點還包括模擬腫瘤和免疫環(huán)境的相互作用關(guān)系。2019年Nature Protocol 期刊發(fā)表了腫瘤類器官和免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)的相關(guān)protocol，可以體現(xiàn)和模擬出腫瘤微環(huán)境的部分特征。以上皮類器官和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型為例，可通過在培養(yǎng)基中添加活化的免疫細(xì)胞、在組織消化成單細(xì)胞后和免疫細(xì)胞共同生長、添加ECM中的重組細(xì)胞因子等方法重塑類器官和免疫細(xì)胞的相互作用。

相比于單個類器官，類器官系統(tǒng)的構(gòu)建能夠?qū)λ幬锆熜Ш蜐撛诙拘宰龀龈�完整全面的評估。目前類器官僅能檢測出藥物對于腫瘤的抑制效果，對于其他器官組織是否存在其他副作用和安全性風(fēng)險并不能做出預(yù)判。為了解決這一問題，2017年Skardal et al.構(gòu)建了有心臟、肺部、肝臟組成的集成于閉合循環(huán)關(guān)注體中的類器官系統(tǒng)，以達(dá)到全面揭示藥物對不同器官的毒性和藥效的目的.

重復(fù)性和一致性 也是類器官發(fā)展的重大瓶頸，這很大程度上由于過程控制的欠缺與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的空白。類器官培養(yǎng)過程中人為因素的過多參與、自動化程度低導(dǎo)致因為系統(tǒng)偶然性造成的誤差較大。同時，類器官檢測手段十分匱乏，活體觀察主要集中在形態(tài)學(xué)觀察，斷點觀察集中在基于熒光的各類指標(biāo)的檢測，能夠活體實時對類器官各項指標(biāo)進(jìn)行檢測的光學(xué)、電化學(xué)等手段仍較為欠缺。當(dāng)前，類器官很多研究者致力于制造更新的類器官，做出之前未能做出的類器官，我們可以制作海馬體、垂體、腺體、脾、腎的類器官，卻難以確定一個符合要求的類器官需要滿足那些個體的諸如尺寸、形狀、基因表達(dá)量等，群體的諸如類器官之間的方差等統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)。這將限制類器官的高效研究與向臨床研究的轉(zhuǎn)化。

對于類器官培養(yǎng)過程中的工程控制也是亟待解決的問題。當(dāng)前類器官培養(yǎng)大多使用Matrigel水凝膠作為培養(yǎng)基質(zhì)，Matrigel是康寧生命科學(xué)公司生產(chǎn)的Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的膠狀蛋白混合物。Matrigel因其含有外源成分，難以應(yīng)用在人的很多治療場景。另一方面，雖然類器官與微流控技術(shù)已有一些結(jié)合研究的例子，但使用微流控芯片對類器官生存的流體環(huán)境進(jìn)行模擬仍不成熟，如何使用微流控等技術(shù)對類器官培養(yǎng)時流體微環(huán)境進(jìn)行控制是亟待解決的問題。同時，現(xiàn)有類器官的直徑約在100-500μm之間，雖然具有一定程度的尺度效應(yīng)，但還是難以模擬真實組織、器官的場景。倘若要制造尺度更大的類器官，類器官的血管化也是十分重要的問題。

-08-類器官的未來發(fā)展

1、國家政策推動

2021年1月28日，科技部下發(fā)的《關(guān)于對“十四五”國家重點研發(fā)計劃6個重點專項2021年度項目申報指南征求意見的通知》中，把“基于類器官的惡性腫瘤疾病模型”列為“十四五”國家重點研發(fā)計劃中首批啟動重點專項任務(wù)。另外，“十四五”國家重點研發(fā)計劃中重點指出，類器官作為一項重大的技術(shù)突破被用于疾病模型的建立中，且可用于研究病理狀態(tài)下干細(xì)胞變異、異質(zhì)性及其發(fā)生機理，挖掘疾病診療的新靶標(biāo)，探索診療新策略。類器官技術(shù)在未來將有非常大的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。

數(shù)據(jù)來源：科技部

2、類器官技術(shù)發(fā)展

傳統(tǒng)制備法，是一種依賴于生長因子的3D培養(yǎng)技術(shù)，有其局限性（比如對類器官及局部環(huán)境的控制不夠精確）。此外，傳統(tǒng)制備法不能很好地復(fù)制器官發(fā)展過程中復(fù)雜又動態(tài)的微環(huán)境，而這種微環(huán)境恰恰是器官形成的有利因素，這就使得獲取更完整的類似體內(nèi)器官發(fā)展的類器官過程困難重重。

目前最前沿的便是，由器官芯片技術(shù)與類器組合成的“類器官芯片”技術(shù)。類器官不是唯一，多模型的整合才是王道，基于原位組織和動物模型的研究仍將是生物醫(yī)學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)。

類器官已經(jīng)成為一種吸引人、易于從多能干細(xì)胞系復(fù)制的人體外組織模型，但是，以大腦類器官為例，其與原位細(xì)胞類型之間仍存在著很多差異，從而可能會混淆人們對內(nèi)源性腦功能的認(rèn)識，并可能提出關(guān)于神經(jīng)病理學(xué)的誤導(dǎo)性假設(shè)，最終可能誤導(dǎo)治療方法。這就需要對原位組織中的每一種細(xì)胞特性進(jìn)行深入的了解和表征，包括通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和蛋白質(zhì)豐度等方法來表征的細(xì)胞類型；包括空間組織、形態(tài)和物理連接性參數(shù)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)組織；以及包括代謝狀態(tài)和電生理在內(nèi)的細(xì)胞和組織功能指標(biāo)。

在今天，類器官尚且無法獨當(dāng)一面，而未來，類器官也不需獨當(dāng)一面，多模型的整合才是研究的最佳方案。展望未來，類器官研究前景巨大。類器官高度仿真的疾病模型有望繼續(xù)在精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域取得新的進(jìn)展。同時，“ 類器官+”，有望給類器官研究帶來新的增長點。與活體實時成像技術(shù)結(jié)合的類器官技術(shù)有望讓人們第一次實時觀察到人早期發(fā)育過程；與生物3D打印相結(jié)合，有望實現(xiàn)基于類器官的功能性治療；與“人類細(xì)胞圖譜 (Human Cell Atlas, HCA)”技術(shù)結(jié)合，類器官細(xì)胞圖譜將推進(jìn)病加速包括罕見遺傳病、復(fù)雜多因素疾病、精準(zhǔn)腫瘤治療等以疾病為中心的研究。