Cell子刊揭秘腸癌幫兇：共生梭菌如何在人體內(nèi)發(fā)揮促癌作用？
結(jié)直腸癌（CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。CRC的發(fā)生和發(fā)展是一個多步驟過程，受到包括遺傳因素和環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素的復(fù)雜影響。近年來，腸道菌群失調(diào)，特別是某些特定細菌，如具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）、腸毒性脆弱擬桿菌（ETBF）和某些類型的大腸桿菌（E.coli）等，在CRC發(fā)生中的作用越來越受到關(guān)注。
2024年8月5日，上海仁濟醫(yī)院房靜遠教授團隊在著名學(xué)術(shù)期刊Cell Host & Microbe（IF 20.6）在線發(fā)表了題為“BCAA-producing Clostridium symbiosum Promotes Colorectal Tumorigenesis Through the Modulation of Host Cholesterol Metabolism”的研究論文。通過隊列研究、多組學(xué)技術(shù)、動物模型、功能驗證等多種研究方法，揭示了共生梭菌C.symbiosum及其代謝產(chǎn)物與CRC患者臨床特征的關(guān)聯(lián)及其致癌機制。（麥特繪譜提供Q300全定量檢測服務(wù)）
此前，房靜遠教授團隊多次與麥特繪譜合作在腸菌研究方向發(fā)表了多篇研究文章，成果展示如下：
●Disruption of CerS6-mediated sphingolipid metabolism by FTO deficiency aggravates ulcerative colitis（Gut，2023IF=24.5，麥特繪譜提供神經(jīng)酰胺定量檢測服務(wù)）
研究思路
圖1. 技術(shù)路線
研究結(jié)果
1. C.symbiosum在CRC患者中的臨床特征
建立臨床隊列，在隊列1中納入130名CRC患者，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的C. symbiosum豐度顯著高于正常組織且C. symbiosum在腫瘤組織中的水平與腫瘤大小呈正相關(guān)。根據(jù)從公共數(shù)據(jù)集檢索的宏基因組數(shù)據(jù)，在幾個西方隊列中進一步驗證了CRC患者糞便中C. symbiosum顯著富集。在隊列2中，對290名結(jié)直腸腺瘤（CRA）患者進行有效監(jiān)測，結(jié)果顯示，高C. symbiosum豐度的患者，CRA復(fù)發(fā)的病例更多。綜合隊列1和隊列2的結(jié)果表明C. symbiosum水平不僅在CRC患者的糞便中升高，而且在腫瘤組織中也升高。
圖2. C. symbiosum在腺瘤復(fù)發(fā)患者中富集，與結(jié)直腸癌患者的臨床特征相關(guān)
2.C. symbiosum促進結(jié)直腸癌的發(fā)生和生長
根據(jù)前文提到的臨床表征，建立了3種細菌缺失小鼠模型，即結(jié)腸炎相關(guān)癌(CAC)模型、偶氮甲烷(AOM)為基礎(chǔ)的散發(fā)性腫瘤模型和ApcMin/+小鼠模型，進一步探索C. symbiosum對結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的影響。在CAC模型中，C. symbiosum灌胃組小鼠的結(jié)腸腫瘤數(shù)量和腫瘤負荷顯著增加，組織學(xué)和免疫組化檢查顯示，C. symbiosum小鼠出現(xiàn)了高級別異型增生，且腫瘤區(qū)域和正常上皮中的Ki67陽性細胞（高Ki67表達通常與腫瘤細胞的高度增殖活性和更差的預(yù)后相關(guān)）比例較高，表明C. symbiosum促進了上皮細胞的增殖。在ApcMin/+小鼠模型和AOM誘導(dǎo)的散發(fā)性腫瘤模型中，也得到了類似的結(jié)果，證實了C. symbiosum增加了結(jié)腸腫瘤數(shù)量和腫瘤負荷。
此外，為了排除SPF小鼠受到的常規(guī)微生物環(huán)境和結(jié)腸免疫微環(huán)境的影響，采用無菌小鼠模型進行了驗證，結(jié)果也證實了C. symbiosum促進結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和生長及Ki67細胞的增殖。
結(jié)合體外細胞功能實驗，發(fā)現(xiàn)C. symbiosum顯著促進了正常上皮細胞系NCM460和結(jié)腸癌細胞系HT29、HCT116的增殖。
圖3. C. symbiosum在體內(nèi)和體外促進結(jié)直腸腫瘤發(fā)生和腫瘤生長
3.C. symbiosum增強小鼠結(jié)腸干細胞特性
進一步剖析C. symbiosum對小鼠結(jié)腸組成和功能的影響，對無菌小鼠的結(jié)腸組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析，捕獲到14067個細胞，包括多種上皮細胞、免疫細胞和間質(zhì)細胞。通過研究干細胞標記基因表達情況，發(fā)現(xiàn)空白組、AOM/DSS處理組和C. symbiosum定殖AOM/DSS誘導(dǎo)組的干細胞比例逐步增加，表明C. symbiosum可能在結(jié)腸干細胞的增殖和更新中扮演重要角色，進而促進結(jié)腸腫瘤的發(fā)生�；诖私Y(jié)果，從AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠模型中分離出結(jié)腸腫瘤干細胞，并進行類器官形成實驗，發(fā)現(xiàn)C. symbiosum顯著促進了腫瘤器官樣體的形成和生長。極限稀釋實驗、腫瘤球體和菌落形成實驗也表明了C. symbiosum顯著促進了結(jié)腸腫瘤的生長。
圖4. 在體內(nèi)和體外均可提高結(jié)腸干細胞的比例，促進干細胞的形成
4. C.symbiosum通過產(chǎn)生BCAAs發(fā)揮致癌作用
使用微生物群耗竭的小鼠模型，通過口服給予磷酸鹽緩沖液（PBS）、活的C. symbiosum以及熱殺死的C. symbiosum，同時誘導(dǎo)小鼠發(fā)生CRC（使用AOM/DSS模型）。實驗結(jié)果顯示，活的C. symbiosum灌胃促進了腫瘤生長，而熱殺死的C. symbiosum則沒有這種效果，表明C. symbiosum可能通過產(chǎn)生生物活性因子來發(fā)揮其增殖作用。與此同時，來自C. symbiosum定殖小鼠的糞便代謝產(chǎn)物和CFS（C. symbiosum的無細胞上清液）均能促進CRC細胞系的增殖，進一步支持了C. symbiosum的相關(guān)代謝物是其致癌作用的基礎(chǔ)。對C. symbiosum定殖小鼠的糞便樣本進行了全定量靶向代謝組學(xué)分析（麥特繪譜提供），發(fā)現(xiàn)78種代謝產(chǎn)物顯著改變，其中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸途徑高度富集，即支鏈氨基酸（BCAAs）在C. symbiosum定殖小鼠的糞便中顯著升高。
使用BCAA缺乏的飲食模型結(jié)合C. symbiosum灌胃，發(fā)現(xiàn)低BCAA飲食在一定程度上抑制了ApcMin/+小鼠的腫瘤負荷。此外，通過CRISPR-Cas12a系統(tǒng)構(gòu)建了ilvE基因干擾的C. symbiosum（ilvEi），該菌株BCAA分泌能力顯著降低，其在微生物群耗竭的ApcMin/+小鼠模型中的致癌作用也明顯受到抑制。
圖5. C.symbiosum通過產(chǎn)生BCAAs發(fā)揮致癌作用
5. C. symbiosum通過mTORC1信號傳導(dǎo)促進細胞膽固醇合成
通過IPA分析三種BCAAs和宿主中與細胞生長和增殖相關(guān)的信號節(jié)點，發(fā)現(xiàn)BCAAs與mTORC1（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1，細胞生長和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）信號通路之間存在高度連接的網(wǎng)絡(luò)。scRNA-seq的通路富集分析顯示，在C. symbiosum定植的小鼠中，mTORC1在干細胞群體中是最顯著的通路。
結(jié)合體內(nèi)實驗、體外實驗以及使用雷帕霉素抑制mTORC1進一步證實了C. symbiosum能顯著刺激mTORC1信號，證明了mTORC1在C. symbiosum促瘤過程的關(guān)鍵作用。
此外，通過RNA-seq和scRNA-seq的通路富集分析，膽固醇穩(wěn)態(tài)通路均被富集，表明C. symbiosum可能影響膽固醇代謝。在細胞實驗中，與C. symbiosum共培養(yǎng)的NCM460、HT29和HCT116細胞的游離和總膽固醇水平顯著增加，使用雷帕霉素處理顯著降低HCT116細胞中的膽固醇含量，表明mTORC1信號對膽固醇合成有重要影響。
圖6. C. symbiosum通過mTOR信號傳導(dǎo)促進細胞膽固醇合成
6. C. symbiosum通過調(diào)控膽固醇合成來促進細胞增殖和干細胞特性的機制
qPCR和Western Blot結(jié)果顯示NCM460、HT29和HCT116細胞與C. symbiosum共培養(yǎng)時，參與膽固醇合成的基因（HMGCR、LSS、SC5D和DHCR7）mRNA水平在多重感染（MOI）依賴的方式下普遍上調(diào)。TCGA-COAD和GETEx數(shù)據(jù)庫分析顯示了HMGCR在CRC腫瘤樣本中的表達顯著上調(diào)，siRNA敲低實驗及患者隊列數(shù)據(jù)分析也論證了C. symbiosum通過調(diào)控HMGCR促進膽固醇合成。
進一步研究C. symbiosum促進細胞增殖和干細胞特性是否依賴于膽固醇合成，使用HMGCR抑制劑辛伐他�。╯imvastatin）來阻斷細胞內(nèi)的膽固醇合成，體內(nèi)和體外實驗證明了C. symbiosum確實通過調(diào)控膽固醇合成來促進細胞增殖。
圖7. 抑制膽固醇合成一定程度消除了C. symbiosum促進的細胞增殖
7. C. symbiosum通過誘導(dǎo)膽固醇合成激活Hedgehog信號通路
大量研究表明膽固醇主要是通過觸發(fā)Sonic Hedgehog（SHH）信號通路的激活來維持癌細胞干細胞特性，基于此觀點，使用qPCR和免疫印跡技術(shù)檢測了SHH信號通路的關(guān)鍵節(jié)點基因GLI1和SHH的表達，結(jié)果顯示C. symbiosum處理以MOI依賴的方式誘導(dǎo)了SHH信號通路的激活，體內(nèi)實驗和患者的腫瘤活檢樣本中也發(fā)現(xiàn)了SHH信號通路的激活。此外，特異性驗證也表明了C. symbiosum對SHH信號通路的特異性影響，WNT和NOTCH信號通路的相關(guān)基因mRNA水平并未發(fā)生變化。在HT29和HCT116細胞中敲低HMGCR后，C. symbiosum誘導(dǎo)的GLI1和SHH上調(diào)被顯著廢除，進一步證明了膽固醇合成在SHH信號通路激活中的關(guān)鍵作用。
圖8. C. symbiosum上調(diào)細胞膽固醇合成激活hedgehog信號傳導(dǎo)
總結(jié)
共生梭菌在結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中選擇性富集，并與結(jié)直腸腺瘤復(fù)發(fā)率相關(guān)，在多種小鼠模型中印證了共生菌的致瘤作用。單細胞轉(zhuǎn)錄組分析和功能分析表明，C. symbiosum促進結(jié)腸癌干細胞的增殖并增強癌癥的干性。通過靶向代謝組學(xué)分析，C. symbiosum通過產(chǎn)生支鏈氨基酸來增強細胞膽固醇合成，激活Sonic hedgehog信號傳導(dǎo)。低BCAA攝入或他汀類藥物阻斷膽固醇合成可在體內(nèi)和體外部分阻斷共生菌誘導(dǎo)的細胞增殖。
參考文獻
BCAA-producing Clostridium symbiosum Promotes Colorectal Tumorigenesis Through the Modulation of Host Cholesterol Metabolism. Cell Host & Microbe. 2024
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繪譜幫你測
本研究中使用Q300全定量靶向代謝組學(xué)技術(shù)對C. symbiosum定殖小鼠的糞便樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸顯著升高，成為本文科研思路的重要線索，為之后發(fā)現(xiàn)膽固醇調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。麥特繪譜開創(chuàng)性地搭建了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高端代謝組學(xué)技術(shù)平臺，覆蓋了非靶向-全定量-代謝流等全方位的高端醫(yī)學(xué)代謝組解決方案，同時全面布局微生物組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)服務(wù)，已成為全球多組學(xué)研究者的優(yōu)選合作伙伴。麥特繪譜擁有Q1000，Q500、Q300、Q200和膽汁酸、短鏈脂肪酸、色氨酸及咧咪衍生物、多胺和TMAO類等各類小分子代謝物、非靶向代謝組學(xué)和同位素示蹤代謝流技術(shù)等共40+系列檢測方法；已為數(shù)百家三甲醫(yī)院、科研院所和企業(yè)提供多組學(xué)解決方案，協(xié)助客戶與合作伙伴發(fā)表SCI文章400+篇，累計影響因子4000+，平均IF>10，包括Cell, Nature, Science, Cell Metabolism, Immunity, Gut, Hepatology, Microbiome等權(quán)威期刊。
