Coral Life 提供了簡(jiǎn)化的活細(xì)胞 CLEM 解決方案，用于深入了解細(xì)胞成分隨時(shí)間發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化。除了工作流程手冊(cè)中描述的技術(shù)處理外，本文還提供了成功進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的其他知識(shí)。

在本例中，主要關(guān)注點(diǎn)是兩個(gè)有絲分裂細(xì)胞的最終分離，即脫落。胞質(zhì)分裂后，兩個(gè)分裂細(xì)胞僅通過(guò)細(xì)胞間橋相連，這細(xì)胞間橋還需要被進(jìn)一步研究。由于其體積龐大，活細(xì)胞成像無(wú)法完全了解這一機(jī)制。因此，需要通過(guò)超微結(jié)構(gòu)分析來(lái)了解最終細(xì)胞分離的內(nèi)在機(jī)制。

 

藍(lán)寶石的制備

6 毫米藍(lán)寶石盤(pán)需要在實(shí)際實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行清潔。清洗步驟如下：

1、在通風(fēng)櫥中將藍(lán)寶石盤(pán)放入濃鹽酸（HCl 30%）中浸泡 2 小時(shí)。

2、用雙蒸（dd）H₂O 沖洗藍(lán)寶石盤(pán) 3 次，每次 5 分鐘。

3、之后將藍(lán)寶石盤(pán)放在濾紙上晾干。

清洗過(guò)程結(jié)束后，需要在干凈的藍(lán)寶石盤(pán)上噴鍍出網(wǎng)格圖案。這一步至關(guān)重要！該圖案可確保日后在樹(shù)脂塊中輕松檢索樣品位置和感興趣的區(qū)域。在藍(lán)寶石上繪制圖案的步驟如下：

1、將一個(gè)干凈的藍(lán)寶石盤(pán)放入鍍膜安裝座的每個(gè)相應(yīng)位置，并在上面添加一個(gè) 6 毫米的finder柵格掩模（圖1）。Finder 柵格掩膜外圍有一個(gè)凹槽，用于指示掩膜的方向。所有掩膜應(yīng)具有相同的方向，以便在后續(xù)步驟中始終顯示藍(lán)寶石的正確方向。建議將finder光柵掩模放在能產(chǎn)生可讀字母的方位。

2、對(duì)于掩膜的噴鍍，可以使用金或碳。在此，使用 EM ACE 600 碳線以脈沖模式（雙線、100 毫米距離、210 瓦、150 毫秒脈沖長(zhǎng)度）進(jìn)行碳涂層。在藍(lán)寶石上沉積了厚度為 10 納米的碳層。

• 確保關(guān)閉旋轉(zhuǎn)。這將使網(wǎng)格圖案更加清晰。

• 根據(jù)鍍膜儀和噴鍍技術(shù)的不同，可能需要噴鍍更厚的碳層才能獲得良好的可見(jiàn)度。

• 如果使用碳，不要忘記將碳層穩(wěn)定在 180 攝氏度以上過(guò)夜。

3、現(xiàn)在藍(lán)寶石已準(zhǔn)備就緒，可以按照工作流程手冊(cè)的說(shuō)明設(shè)置 SampLink chamber。確保碳層朝向 SampLink chamber的內(nèi)部。細(xì)胞需要在碳層頂部生長(zhǎng)。

圖 1：藍(lán)寶石上用于后續(xù)噴鍍的finder柵格掩模的方向

在將細(xì)胞種植到組裝好的 SampLink 細(xì)胞室之前，需要再次對(duì)細(xì)胞室進(jìn)行清潔和滅菌。在細(xì)胞培養(yǎng)罩中執(zhí)行以下步驟：

1、在SampleLink中注入 1 毫升 70% 乙醇并孵育 5 分鐘。

2、用 dd H₂O 沖洗 3 次。

3、讓其干燥過(guò)夜。

4、紫外線滅菌至少 1 小時(shí)。

第二天：

1、用 PBS 沖洗 3 次。

2、加入 1 毫升 PBS 或培養(yǎng)基，將SampleLink放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜。

3、培養(yǎng)結(jié)束后用 dd H₂O 沖洗。

SampleLink即可使用。將細(xì)胞直接種在藍(lán)寶石上，或種在附加的聚合物或多肽涂層上。在這里，藍(lán)寶石上的碳網(wǎng)格圖案上涂有聚-L-賴氨酸（broid P1274，分子量 70,000-150,000 ，Sigma-Aldrich）。涂層用 0.1 mg/ml dd H₂O 稀釋。在每塊藍(lán)寶石上加入 50μl 5 分鐘，然后沖洗（3 次 dd H₂O），并在通風(fēng)櫥中干燥 2 小時(shí)。

 

細(xì)胞孵育

這些實(shí)驗(yàn)使用了在 DMEM 培養(yǎng)基（10 % FCS ，1 % 青霉素/鏈霉素）中培養(yǎng)和孵育的 HeLa Kyoto HKF1、H2B-mCherry、alphaTubulin、mEGFP 細(xì)胞系。

1、每個(gè)SampLink chamber培養(yǎng)66,000個(gè)細(xì)胞，在37°C、5% CO₂ 條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)。

在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中，將 6 個(gè)開(kāi)放的 SampLinks 放入 140 毫米的培養(yǎng)皿中，然后蓋上培養(yǎng)皿。在實(shí)際成像實(shí)驗(yàn)之前，需要將 SampLinks 完全組裝好。按照 Coral Life 手冊(cè)第 5.2.4 節(jié)的說(shuō)明組裝 SampLink 室。

如果直接在 OxyGenie 中培養(yǎng) SampLinks，則需要在播種后直接組裝 SampLinks chamber。注意：OxyGenie 需要 30 分鐘左右加熱。

2、在這些實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng) 24 小時(shí)后細(xì)胞的密度達(dá)到約 70%。

活細(xì)胞成像

一旦細(xì)胞達(dá)到所需的密度，6個(gè)SampLink  chamber就可以安全地從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到顯微鏡實(shí)驗(yàn)室。

若THUNDER顯微鏡與SampLink  chamber一起用于成像，以下是一些關(guān)于成像參數(shù)的提示和技巧：

圖 2：這里顯示的是螺旋掃描的一部分。在透射光下，碳涂層網(wǎng)格圖案清晰可見(jiàn)。

通過(guò)定位字母 I、J、O、P（箭頭）可以很容易地找到網(wǎng)格圖案的中心（星號(hào)）。

 

1、設(shè)置平臺(tái)的轉(zhuǎn)移位置，以便之后輕松卸載SampLink chamber進(jìn)行冷凍。

 

2、生成定位概覽：

根據(jù)網(wǎng)格圖案手動(dòng)識(shí)別藍(lán)寶石片中心（見(jiàn)圖2）。

確定后，從中心開(kāi)始快速螺旋掃描，覆蓋整個(gè)區(qū)域，以獲得初步的快速概覽。這樣可以快速檢查方向。此處直接使用 40x 水浸物鏡。

為了進(jìn)一步識(shí)別感興趣的區(qū)域，還進(jìn)行了帶焦點(diǎn)圖的螺旋掃描。這樣做的好處是，如果藍(lán)寶石片或chamber不完全平整，焦點(diǎn)就會(huì)得到修正。可以在多個(gè)通道中創(chuàng)建帶聚焦圖的序列掃描（圖3）。建議逐個(gè)通道運(yùn)行，完成后再合并。

 

3、完成后，確定感興趣區(qū)域 (ROI)，如圖 4 所示。每塊藍(lán)寶石片可以使用一個(gè)以上的 ROI 進(jìn)行下游分析。但必須確保區(qū)域之間有足夠的空間，以便修整或分割樹(shù)脂塊。

圖 3：使用 40x/1.1 NA 藍(lán)寶石校正水浸物鏡采集的螺旋掃描圖。A）透射光；B）熒光通道--510 納米波長(zhǎng)照明。

在本示例中，觀察從細(xì)胞分裂開(kāi)始。60 分鐘后固定樣本。根據(jù)相關(guān)過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化，您需要選擇不同的成像時(shí)間間隔。就本文而言，每分鐘 1 張圖像足以跟蹤細(xì)胞分裂和脫落。

A：使用 40x/1.1 NA 藍(lán)寶石校正物鏡獲得的螺旋掃描圖像。B：放大的 A 中圓圈所示區(qū)域。感興趣的分裂細(xì)胞位于中心。

 

冷凍替代和包埋

本例中使用的是整體冷凍替代方案。這種技術(shù)可在樣品內(nèi)部進(jìn)行強(qiáng)烈的金屬染色，從而在掃描電鏡成像時(shí)獲得良好的對(duì)比度。它也可用于 TEM 成像；不過(guò)，由于脂質(zhì)上的強(qiáng)金屬堆積，分辨率會(huì)略有降低。在高倍放大鏡下，樣品會(huì)顯得模糊不清。所使用的冷凍替代液含有 1% OsO4 + 0.2% 醋酸鈾酰 + 2.5% H₂O 的純丙酮。

將樣品在液氮下放入冷凍替代液中，然后轉(zhuǎn)移到-90°C的預(yù)冷 EM AFS2 系統(tǒng)中：

冷凍替代

• -90°C，在冷凍替代液中放置 48 小時(shí)
• 每小時(shí)升高 5 攝氏度，直至 -30 攝氏度
• 保持 -30°C 4 小時(shí)
• 以 5°C/h 的速度遞增，直至 20°C
• 保持 20 攝氏度 5 小時(shí)
   

對(duì)比

• 在丙酮中清洗 3 x 10 分鐘
• 在丙酮中加入 1% 的硫代酰肼，在室溫條件下 20 分鐘
• 在丙酮中清洗 3 x 10 分鐘
• 2% 四氧化鋨在丙酮中，室溫條件下 20 分鐘
• 在丙酮中洗滌 3 x 10 分鐘
• 2% 醋酸鈾酰，丙酮，60°C，20 分鐘
• 在丙酮中清洗 3 x 10 分鐘
   

滲透

• 30% Durcupan 在丙酮中浸泡 3 小時(shí)
• 70% Durcupan 在丙酮中浸泡 3 小時(shí)
• 100% Durcupan 3 小時(shí)
• 100% Durcupan 過(guò)夜
• 100% Durcupan 3 小時(shí)
• 60°C 下聚合 48 小時(shí)

 

包埋完成后，將通流環(huán) (16707161) 放入試劑槽 (16700154) 并注入一半的新鮮樹(shù)脂。將藍(lán)寶石轉(zhuǎn)移到通流環(huán)中，用體視顯微鏡檢查finder柵格的可讀性（圖5）。然后，將通流環(huán)完全填滿，并將樣品放入 60°C 的烘箱中 48 小時(shí)。

 

取樣和切片

工作流程中最關(guān)鍵的步驟之一是取回樹(shù)脂塊中的 ROI，然后進(jìn)行修塊和成像。為了檢查樣品是否保存完好，建議在聚合后對(duì)樹(shù)脂塊的塊面進(jìn)行快速成像。在本實(shí)驗(yàn)中，將光學(xué)顯微鏡的數(shù)據(jù)與樹(shù)脂塊表面的圖像進(jìn)行了如下關(guān)聯(lián)：

• 將樣品從聚合的流動(dòng)環(huán)中取出后，用手術(shù)刀從藍(lán)寶石背面刮去殘留的樹(shù)脂薄層
• 用乙醇浸濕的紙巾清除殘留碎屑
• 用金屬夾具將樣品塊固定在THUNDER顯微鏡載物臺(tái)上，使藍(lán)寶石片（幾乎）垂直于顯微鏡的光軸
• 通過(guò)樹(shù)脂塊的透射照明可用于成像
• 或者，也可利用樹(shù)脂塊在藍(lán)光（470納米）下的自發(fā)熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行“背照”
• 首先使用螺旋掃描對(duì)樹(shù)脂塊進(jìn)行定位
• 然后繪制包含 5 個(gè)聚焦點(diǎn)的聚焦圖和整個(gè)塊面的圖像掃描圖
• 將掃描圖像與概覽圖像合并，并導(dǎo)出為 tiff 和 jpg 文件
• jpg 文件可通過(guò) Microsoft Office 的成像工具以正確的放大率疊加到活細(xì)胞圖像上；使用 tiff 文件和 Fiji 軟件可完成更復(fù)雜的疊加程序

圖 5：左：透過(guò)藍(lán)寶石拍攝的塊面透射光圖像。右圖 塊面圖像與之前活體成像的相應(yīng)熒光圖像的疊加。

注：在高壓冷凍過(guò)程中，單個(gè)細(xì)胞或有時(shí)成批細(xì)胞從藍(lán)寶石上脫落是正常現(xiàn)象。高密度或與基底結(jié)合不牢固的細(xì)胞（即有絲分裂細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儠?huì)變圓，因此與基底的附著點(diǎn)會(huì)減少）會(huì)產(chǎn)生這種效果。使用較低的細(xì)胞密度和/或不同類型和濃度的涂層可以減少玻璃化過(guò)程中細(xì)胞的損失。

 

然后將藍(lán)寶石從塊面上剝離：

1、首先修剪掉藍(lán)寶石周圍過(guò)多的樹(shù)脂。這可以用厚重的刀片來(lái)完成。

2、加熱 EM MP 系統(tǒng) (16705403)，準(zhǔn)備一個(gè)裝有 LN2 的小杜瓦瓶。

3、用鑷子夾住樹(shù)脂塊

4、將樹(shù)脂塊正面朝下放在熱的 EM MP 上 10-20 秒。

5、然后將樹(shù)脂塊直接浸入液氮中冷卻。您會(huì)聽(tīng)到“咔嚓”一聲。

6、用體視顯微鏡觀察時(shí)，將鋒利的刀片插入樹(shù)脂和藍(lán)寶石片之間。藍(lán)寶石片應(yīng)該很容易與樹(shù)脂分離。否則，請(qǐng)重復(fù)加熱/冷卻步驟。

7、移除藍(lán)寶石片后，您應(yīng)該仍能觀察到區(qū)塊上的碳圖案。

利用finder柵格的網(wǎng)格圖案，您可以在區(qū)塊上找到 ROI 并將其修剪下來(lái)。在這里，使用 EM TRIM2 對(duì)包埋塊進(jìn)行了修整。

在本例中，由于只有 5-7 個(gè)部分包含目標(biāo)特征，因此必須進(jìn)行序列切片。因此，切片被安裝在slot grids上。由于使用了整體冷凍替代和滲透方案，因此無(wú)需進(jìn)行后期染色。

圖 6：分裂的 HeLa 細(xì)胞的合并 TEM 圖像，仍由細(xì)胞間橋連接。樣品用 Morgagni 80 kV TEM（ Thermo Fisher）成像。

圖 7：分裂的 HeLa 細(xì)胞的 TEM 圖像，仍由細(xì)胞間橋連接。

 

數(shù)據(jù)后處理

本實(shí)驗(yàn)使用THUNDER技術(shù)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理。要了解有關(guān)THUNDER技術(shù)的更多信息，以及如何在 Coral Life 工作流程中使用THUNDER技術(shù)進(jìn)行后處理和定位，請(qǐng)掃碼查閱應(yīng)用說(shuō)明：“如何使用 Coral Life 改進(jìn)活細(xì)胞成像”。

圖 8：A) 感興趣細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn) WF 圖像，使用綠色和紅色熒光通道成像。B) 使用THUNDER小體積計(jì)算技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理。

 

圖像相關(guān)性

最終的圖像相關(guān)性取決于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的要求，可以是將不同的圖像結(jié)果并排放置，也可以是更詳細(xì)的二維和三維圖像相關(guān)性，從而提取超微結(jié)構(gòu)和活細(xì)胞數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。在本例中，創(chuàng)建了 LM 和 EM 數(shù)據(jù)的疊加。為了進(jìn)行匹配疊加，需要在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡圖像上放置地標(biāo)。為此，需要疊加無(wú)褶皺變形的圖像。

 

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡圖像的疊加。

圖 9：光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡圖像的疊加。

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