1背景介紹 

細(xì)胞-細(xì)胞融合過(guò)程在神經(jīng)傳遞、外排與內(nèi)吞、信號(hào)傳導(dǎo)與病毒感染等生物轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用。開(kāi)發(fā)自組織功能細(xì)胞樣的微/納米容器，即原細(xì)胞(Protocells)，是快速發(fā)展的“系統(tǒng)化學(xué)”領(lǐng)域的主要目標(biāo)。不同的原始細(xì)胞內(nèi)含物包括脂質(zhì)體(liposomes)、聚合體(polymersomes)、樹(shù)突體(dendrosomes)、蛋白質(zhì)體(proteinsomes)、水微滴(aqueousmicrodroplets)和水凝膠微膠囊(hydrogelmicrocapsules)。通過(guò)這些組件的整合，細(xì)胞樣環(huán)境中存在裝配催化、光催化、和生物催化等反應(yīng)。細(xì)胞樣內(nèi)含物的融合以及原始細(xì)胞內(nèi)部與外部環(huán)境之間化學(xué)物質(zhì)的交換產(chǎn)生了功能性微/納米儲(chǔ)庫(kù)，揭示了細(xì)胞內(nèi)編程的催化功能或用于治療應(yīng)用的功能性“智能”藥物載體。同時(shí)，細(xì)胞外囊泡及其在細(xì)胞間傳遞核酸和蛋白質(zhì)的生理功能越來(lái)越多引起人們的研究興趣。特別是，研究集中于模擬天然系統(tǒng)的合成類似物的發(fā)展，并努力確定合成細(xì)胞外囊泡的臨床應(yīng)用。

論文導(dǎo)讀

該研究報(bào)道了報(bào)告三種不同負(fù)載的脂質(zhì)體逐步融合到集成的功能原始細(xì)胞模型系統(tǒng)。具體地說(shuō)，研究者解決了逐步光和pH觸發(fā)的核酸修飾脂質(zhì)體的融合，在其中加入了休眠的、非活性的負(fù)載。存在于分離的脂質(zhì)體中的成分，在融合后產(chǎn)生相互通信成分的集成合成細(xì)胞集合，允許生物催化級(jí)聯(lián)操作和指示DNA類型的機(jī)械。該結(jié)果通過(guò)提供構(gòu)建細(xì)胞樣功能容器的方法，推進(jìn)了快速發(fā)展的“合成細(xì)胞”領(lǐng)域。除了模擬自然過(guò)程的重要意義之外，該研究還證明了生物催化級(jí)聯(lián)作為監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體融合的工具的成功應(yīng)用，以及在受限環(huán)境中為DNA機(jī)器的動(dòng)態(tài)調(diào)制而設(shè)計(jì)納米組件的手段。

三種核酸功能化脂質(zhì)體以光和pH為觸發(fā)點(diǎn)的逐步融合原理，以及融合過(guò)程的物理、光譜和成像方法如圖1所示。

圖1. 以光和pH為觸發(fā)劑的三種脂質(zhì)體(A)、(B)和(C)的逐步融合示意圖。

圖2. 磺胺若丹明B的時(shí)間熒光變化

圖2中的曲線(i)描述了脂質(zhì)體(a)用(b)在pH = 5.0條件下，用(b)逐步照射(波長(zhǎng)為365 nm)，然后用脂質(zhì)體(c)處理光融合脂質(zhì)體(pH = 5.0)后脂質(zhì)體系統(tǒng)的熒光變化。脂質(zhì)體(a)和(b)在波長(zhǎng)為365 nm時(shí)輻照，熒光增強(qiáng)，在≈1000 s后趨于穩(wěn)定，這與脂質(zhì)體的融合和熒光標(biāo)記的稀釋一致。用脂質(zhì)體(c)進(jìn)一步處理融合脂質(zhì)體，進(jìn)一步增強(qiáng)了磺胺嘧啶B標(biāo)記的時(shí)間依賴性熒光變化，也達(dá)到飽和水平。脂質(zhì)體中熒光標(biāo)記的進(jìn)一步增加與三種脂質(zhì)體融合容器中熒光標(biāo)記的融合引導(dǎo)稀釋一致。值得注意的是，脂質(zhì)體逐步融合后，對(duì)脂質(zhì)體溶液進(jìn)行色譜分離，探測(cè)其周圍體積溶液中是否存在磺胺丹B。洗脫液中檢測(cè)不到稀釋后的熒光染料的熒光信號(hào)，從而消除了融合過(guò)程中染料泄漏的可能。此外，需要注意的是，硫磺胺B在融合第二步的熒光變化明顯低于脂質(zhì)體(a) + (B)的融合**步，這是由于熒光的非線性聚合染料稀釋后的變化。

此外，圖3展示稀釋后磺胺B的非線性熒光變化。利用(a) + (b)和(a) + (b) + (c)融合脂質(zhì)體的逐步大小變化，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）評(píng)估，淬滅的熒光團(tuán)標(biāo)記沒(méi)有從脂質(zhì)體中泄漏，可以估計(jì)融合后探針的稀釋系數(shù)，并進(jìn)一步評(píng)估兩步融合過(guò)程中熒光變化的程度。通過(guò)這一過(guò)程，驗(yàn)證了圖1曲線所示的淬滅熒光團(tuán)探針的實(shí)驗(yàn)熒光變化，每一步的融合效率≈80-85%。已知脂質(zhì)體的初始濃度和三脂質(zhì)體的總體融合效率≈80-85%，我們估計(jì)融合的三脂質(zhì)體的濃度為≈2.7×10¹²脂質(zhì)體/mL，該值與NanoCoulter粒度儀裝置評(píng)估的濃度一致（具體操作如下）。

脂質(zhì)體的制備。將4 mM DOPC（二油�；�卵磷脂）、2 mM CHOL（膽固醇）加入10 mL圓底燒瓶中，溶于4 mL氯仿中。隨后，將原液在氯仿中用氮?dú)庹舭l(fā)形成脂膜，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器下進(jìn)一步干燥。脂膜用20 mM PBS(pH 7.0)水合，*終脂質(zhì)濃度為4 mM。隨后，使用注射器將混懸液重復(fù)通過(guò)包括0.22µm孔的濾膜（聚碳酸酯）21次，以形成脂質(zhì)體混懸液。分別用60~200 nm或150~500 nm兩種測(cè)量范圍的金屬納米孔芯片在NanoCoulter（ResunTech, co., Shenzhen）納米庫(kù)爾特粒度儀上計(jì)算脂質(zhì)體的平均粒徑與數(shù)量（濃度）。

為了進(jìn)行比較，圖2A曲線(ii)描繪了在pH = 8.0下，脂質(zhì)體(a)、(b)和(c)在不輻照的情況下逐步混合后的熒光變化。沒(méi)有觀察到熒光變化，這表明確實(shí)需要光誘導(dǎo)/ ph酸化脂質(zhì)體的耦合動(dòng)態(tài)融合來(lái)刺激脂質(zhì)體混合物中的熒光變化。圖1B描述了脂質(zhì)體組合的時(shí)間尺寸變化，在它們使用光/pH觸發(fā)融合時(shí)。單個(gè)脂質(zhì)體(a)的平均尺寸為225±5 nm，而脂質(zhì)體(a)和脂質(zhì)體(b)的輻照量為365 nm，可使脂質(zhì)體的平均尺寸擴(kuò)大至240±5 nm。(a)/(b)融合脂質(zhì)體與脂質(zhì)體(c)在pH = 5.0條件下處理后，生成的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)尺寸為265±5 nm曲線(i)。與此同時(shí)，脂質(zhì)體(a)與脂質(zhì)體(b)依次處理，然后與脂質(zhì)體(c)依次處理，在沒(méi)有各自的融合觸發(fā)器的情況下，導(dǎo)致脂質(zhì)體的大小不變，曲線(ii)，225±5 nm，證實(shí)沒(méi)有發(fā)生融合。圖1C描繪了脂質(zhì)體在不同融合步驟下的形態(tài)變化所對(duì)應(yīng)的SEM圖像。脂質(zhì)體(a)、(b)和(c)的混合物顯示出直徑約為200 nm的單個(gè)球形結(jié)構(gòu)(圖2)。盡管如此，熒光研究(圖1A)和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了相互作用的脂質(zhì)體之間的負(fù)載交換，以及脂質(zhì)體在連續(xù)光/pH觸發(fā)下的支持大小和形狀變化，將為三種脂質(zhì)體的融合提供令人信服的證據(jù)。

通過(guò)葡萄糖氧化酶(GOx)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)級(jí)聯(lián)在融合容器中成功運(yùn)作，進(jìn)一步證實(shí)了光/ ph誘導(dǎo)脂質(zhì)體(a)、(b)和(c)的連續(xù)融合確實(shí)進(jìn)行了，并導(dǎo)致了融合容器中負(fù)載的交換。研究者提供了通過(guò)脂質(zhì)體-脂質(zhì)體融合過(guò)程激活酶級(jí)聯(lián)的簡(jiǎn)單模型，作為細(xì)胞-細(xì)胞融合引起的生物催化級(jí)聯(lián)的模型。此外，進(jìn)一步的融合脂質(zhì)體引導(dǎo)的DNA機(jī)制也展示了融合脂質(zhì)體原始細(xì)胞中mRNA的轉(zhuǎn)錄（詳細(xì)內(nèi)容可點(diǎn)擊閱讀原文下載獲取）。

文中使用到的NanoCoulter—— 納米庫(kù)爾特粒度儀， 采用新一代庫(kù)爾特原理的電學(xué)檢測(cè)方法，粒徑分辨率可達(dá)到1 nm。依次檢測(cè)樣本中每一個(gè)顆粒，實(shí)現(xiàn)真正意義上的納米單顆粒檢測(cè)，數(shù)據(jù)精度媲美電鏡，一次測(cè)試可獲得多維度顆粒表征數(shù)據(jù)（粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)），為科學(xué)研究、生產(chǎn)品控、醫(yī)藥研發(fā)、疾病診斷等領(lǐng)域，提供精準(zhǔn)支持；更加快速、**的助力病毒顆粒、脂質(zhì)體、外泌體等細(xì)胞外囊泡、乳膠微球、納米磁珠、無(wú)機(jī)納米材料等的研究和表征質(zhì)控。

脂質(zhì)體應(yīng)用案例