近十年,腫瘤微環(huán)境作為腫瘤研究領(lǐng)域的分支之一,在很多方面取得了進(jìn)展,其重要原因在于腫瘤樣本組織具有與生物復(fù)雜性相關(guān)的顯著空間異質(zhì)性。而腫瘤微環(huán)境研究可以揭示其中奧秘。
多重免疫熒光染色作為腫瘤微環(huán)境研究的重要手段之一,可以同時(shí)顯示多種生物標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)識(shí)別細(xì)胞類型,以及研究信號(hào)通路和繪制腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜的細(xì)胞互作圖譜。
盡管近年出現(xiàn)幾種新技術(shù),但在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和診斷領(lǐng)域工作的研究人員和臨床醫(yī)生仍然面臨技術(shù)瓶頸:1)組織微陣列技術(shù)的使用受到腫瘤異質(zhì)性限制,2)新型多維度空間生物學(xué)技術(shù)成本高昂。
在此背景下,Innopsys 開發(fā)了 InnoQuant熒光全玻片掃描儀,其具有經(jīng)過(guò)優(yōu)化的獨(dú)特光學(xué)設(shè)計(jì),可提供高質(zhì)量免疫熒光染色圖片,有助于高內(nèi)涵數(shù)據(jù)的生成和分析。
NSCLC多重組織成像的案例研究
- 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>
研究非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中癌癥組織中的免疫浸潤(rùn)
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的85%。目前,使用靶向腫瘤特定分子特征的治療藥物已成為標(biāo)準(zhǔn)方案。因此,研究腫瘤組織樣本,以此來(lái)表征免疫細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)有助于個(gè)體化的靶向治療。
1.利用多重免疫組織化學(xué)(mIHC)在單一組織切片上同時(shí)染色多種免疫標(biāo)志物
1)PD-L1是一種免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物,在髓系細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá),并作為癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)中作為腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物。
2)顆粒酶B (Granzyme B,GrB)是一種絲氨酸蛋白酶顆粒酶,主要存在于自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的顆粒中,本實(shí)驗(yàn)中作為NK細(xì)胞標(biāo)志物。
3)CD8存在于T細(xì)胞中,本實(shí)驗(yàn)中作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞標(biāo)志物。
4)使用Cell Signaling 公司mIHC熒光抗體進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌樣本染色,具體如下: FITC標(biāo)記PD-L1,AF594標(biāo)記CD8,Cy5標(biāo)記GrB。
2.利用InnoQuant掃描紅色切片
1)利用GrB標(biāo)記物鑒定NK細(xì)胞:采用640 nm激發(fā)波長(zhǎng)產(chǎn)生Cy5信號(hào),通過(guò)680/42 BP濾波器采集其發(fā)射信號(hào)。
2)利用CD8標(biāo)記物鑒定T細(xì)胞:采用561nm激發(fā)波長(zhǎng)產(chǎn)生AF594信號(hào),通過(guò)593/40 BP濾波器采集其發(fā)射信號(hào)。
3.QuPath軟件分析
利用QuPath的深度學(xué)習(xí)功能,分別識(shí)別NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞。采用Delauney聚類特征2D法鑒定NK細(xì)胞簇和CD8+ T細(xì)胞簇。分析3個(gè)相鄰NK或CD8+ T細(xì)胞所包圍的三角形面積與 腫瘤區(qū)域邊界到NK或CD8+ T細(xì)胞中心距離之間的關(guān)系。
1.樣本掃描總體情況:
冷凍切片厚度:5μm。冷凍切片總面積:97 mm2。4個(gè)熒光通道掃描時(shí)間:10分鐘。ROI面積:2 mm2(圖1)。
圖1:NSCLC組織切片全圖,mIHC染色,InnoQuant掃描,后續(xù)分析ROI用黃色圈出
2.自然殺傷(NK)細(xì)胞簇分析
圖2中黃色標(biāo)記區(qū)域?yàn)槟[瘤細(xì)胞區(qū)域,藍(lán)色標(biāo)記NK細(xì)胞分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分NK細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞區(qū)域周圍,部分NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)。
圖2:腫瘤細(xì)胞區(qū)域微環(huán)境中NK細(xì)胞簇的ROI和細(xì)節(jié)(腫瘤細(xì)胞區(qū)域用黃色標(biāo)出,NK細(xì)胞呈藍(lán)色;圖片由InnoQuant獲取,QuPath分析)
三個(gè)NK細(xì)胞間面積(μm2)被定義為由三個(gè)相鄰NK細(xì)胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離(μm)表示NK細(xì)胞質(zhì)心到最近腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正,則NK細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域外部,如距離為負(fù),則NK細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部。
對(duì)距腫瘤細(xì)胞區(qū)域不同距離的相鄰三個(gè)NK細(xì)胞間面積的分析表明,絕大部分相鄰NK細(xì)胞形成的三角形面積都在600μm2以下,且與腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離都在±12μm的范圍內(nèi)。面積越小,證明NK細(xì)胞密度越高,而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。正如圖2中所看到的,NK細(xì)胞的分布受到腫瘤細(xì)胞區(qū)域的影響,絕大部分NK細(xì)胞都圍繞著腫瘤細(xì)胞區(qū)域(圖3)。
圖3:NK細(xì)胞密度與腫瘤細(xì)胞區(qū)域的關(guān)系。左:細(xì)胞圍成的三角形面積與細(xì)胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖?v軸:3個(gè)相鄰NK細(xì)胞圍城的三角形面積。橫軸:NK細(xì)胞中心與腫瘤邊界的距離。右:分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域附近的NK細(xì)胞數(shù)量,按不同距離進(jìn)行分類
圖4中黃色標(biāo)記區(qū)域?yàn)槟[瘤細(xì)胞區(qū)域,品紅色標(biāo)記CD8+ T細(xì)胞分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分CD8+ T細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞區(qū)域周圍,部分CD8+ T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)。
圖4:腫瘤細(xì)胞區(qū)域微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞簇的ROI和細(xì)節(jié)(腫瘤細(xì)胞區(qū)域用黃色標(biāo)出,CD8+ T細(xì)胞呈品紅色;圖片由InnoQuant獲取,QuPath分析)
三個(gè)CD8+ T細(xì)胞間面積(μm2)被定義為由相鄰三個(gè)CD8+ T細(xì)胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離(μm)表示CD8+ T細(xì)胞質(zhì)心到最近腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正,則CD8+ T細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域外部。如距離為負(fù),則CD8+ T細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部。
對(duì)距腫瘤細(xì)胞區(qū)域不同距離的相鄰三個(gè) CD8+ T 細(xì)胞間面積的分析表明,絕大部分相鄰CD8+ T細(xì)胞形成的三角形面積都在600μm2以下,且與腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離都在±12um的范圍內(nèi)。面積越小,證明CD8+ T細(xì)胞密度越高,而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。說(shuō)明正如圖4中所看到的,CD8+ T細(xì)胞的分布受到腫瘤細(xì)胞區(qū)域的影響,絕大部分CD8+ T細(xì)胞都圍繞著腫瘤細(xì)胞區(qū)域(圖5)。
圖5: CD8+ T細(xì)胞密度與腫瘤細(xì)胞區(qū)域的關(guān)系。左:細(xì)胞圍成的三角形面積與細(xì)胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖。縱軸:3個(gè)相鄰CD8+ T細(xì)胞圍城的三角形面積。橫軸:CD8+ T細(xì)胞中心與腫瘤邊界的距離。右:分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域附近的CD8+ T細(xì)胞數(shù)量,按不同距離進(jìn)行分類
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
無(wú)論是NK細(xì)胞還是CD8+ T細(xì)胞,都受到腫瘤區(qū)域的影響,集中分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)外,不斷浸潤(rùn)腫瘤組織。
利用全組織掃描成像并結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法,可以識(shí)別不同免疫細(xì)胞以及分析其與腫瘤區(qū)域的距離。本案例證明了InnoQuant提供的整張掃描圖像可以在第三方分析軟件中生成相關(guān)數(shù)據(jù)。圖像質(zhì)量高,可以得到如細(xì)胞計(jì)數(shù)和鄰近分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以更好地了解患者的特定病理生理狀況。這些空間和定量的數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步預(yù)測(cè)免疫腫瘤領(lǐng)域的治療反應(yīng)。
Innopsys 成立于1999年?偛课挥诜▏(guó),一直致力于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。InnoQuant組織切片/生物芯片掃描儀,采用先進(jìn)的共聚焦PMT檢測(cè)器和多激光掃描光路,可以同時(shí)進(jìn)行多通道熒光檢測(cè)。不僅掃描結(jié)果清晰,而且無(wú)需后續(xù)拼接和陰影校正處理,在組織切片和生物芯片掃描領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
環(huán)亞生物,生命科學(xué)產(chǎn)品全國(guó)性代理商,具備完善的公司運(yùn)營(yíng)、產(chǎn)品管理、營(yíng)銷、售前技術(shù)支持和售后維修體系。環(huán)亞生物作為InnoQuant大中華區(qū)代理商,負(fù)責(zé)InnoQuant產(chǎn)品大中華區(qū)的營(yíng)銷和售后支持。
▼更多 InnoQuant 產(chǎn)品詳情,請(qǐng)聯(lián)系我們▼
環(huán)亞生物科技有限公司
地址:上海市閔行區(qū)友東路358號(hào)閔欣大廈1號(hào)樓701/703/705室
電話:021-54583565
▼更多精彩內(nèi)容,請(qǐng)掃碼關(guān)注我們▼