1 摘要

在過去的20年里，公眾對(duì)營(yíng)養(yǎng)保健品的興趣迅速增長(zhǎng)。許多人開始將營(yíng)養(yǎng)飲料作為餐食替代品和膳食補(bǔ)充劑。許多因素影響著這些飲料的購買和消費(fèi)。其中一個(gè)關(guān)注點(diǎn)包括這些飲料以蛋白質(zhì)、氨基酸和/或脂肪含量的形式為人們的飲食提供的額外營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，對(duì)于制造商來說，分析和控制這些主要成分至關(guān)重要，以優(yōu)化生產(chǎn)、控制成本并生產(chǎn)高質(zhì)量的產(chǎn)品。

傳統(tǒng)的方法通常依賴于繁瑣和耗時(shí)的重力濕化學(xué)技術(shù)。¹作為替代方案，CEM提供了一系列儀器，以更高效、可靠和環(huán)保的方式滿足這些需求。例如，粗脂肪分析的參考方法包括索氏提取法、巴氏提取法和莫諾尼埃提取法。這些技術(shù)依賴于添加溶劑來溶解并分離樣品基質(zhì)中所需的脂肪與其他成分，并且通常伴隨著酸/堿水解。ORACLE™是這些方法的一種吸引人的替代方案，無需任何樣品類型的校準(zhǔn)或方法開發(fā)即可測(cè)量脂肪。ORACLE可以與SMART 6™配對(duì)，直接準(zhǔn)確地確定固體和脂肪含量，只需幾分鐘。

總蛋白質(zhì)測(cè)定也依賴于苛刻的凱氏硫酸消化法，然后通過滴定或燃燒方法來確定總氮含量。Sprint^®使用染料結(jié)合技術(shù)，其中CEM的iTag^®染料分子選擇性地與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸側(cè)鏈結(jié)合。這不僅提供了一種有針對(duì)性的方法，而且還可以在不到五分鐘的時(shí)間內(nèi)完成測(cè)試，并且不需要處理化學(xué)廢物的試劑。

除了總蛋白質(zhì)測(cè)量外，構(gòu)成這些蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的數(shù)量和特性也非常重要。為了分析這些部分，必須切割蛋白質(zhì)酰胺鍵以釋放單個(gè)氨基酸。樣品通常在酸性或堿性條件下處理，在110°C下持續(xù)18至24小時(shí)，然后通過LC-UV或LC-MS技術(shù)對(duì)所得的水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。傳統(tǒng)的加熱機(jī)制具有典型的特征，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且存在不需要的副反應(yīng)困擾著傳統(tǒng)的烘箱方法。CEM的Discover^® Prep微波反應(yīng)器為優(yōu)化氨基酸水解（AAH）反應(yīng)提供了一條更快速和高效的道路。^2,3

在這里，各種營(yíng)養(yǎng)飲料被分析總脂肪、固體和蛋白質(zhì)含量，并使用CEM儀器進(jìn)行LC-UV氨基酸分析的準(zhǔn)備�？傮w而言，這些結(jié)果與傳統(tǒng)的濕化學(xué)技術(shù)相比表現(xiàn)良好，但以更快速、精確和安全的方式進(jìn)行。

2 材料和方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)

化學(xué)品從商業(yè)供應(yīng)商購買，未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。所有溶液在使用前新鮮制備。各種營(yíng)養(yǎng)飲料從當(dāng)?shù)仉s貨店購買，并在分析之前存放在干燥和陰涼的地方。所有樣品進(jìn)行分析，一旦打開即儲(chǔ)存在4°C。

分析

將SMART 6、ORACLE和Sprint獲得的分析結(jié)果與傳統(tǒng)濕化學(xué)方法獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，傳統(tǒng)濕化學(xué)方法分別對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的AOAC參考方法（990.20）固體、（989.05）脂肪和（981.10）蛋白質(zhì)。

將Discover Prep的效果與傳統(tǒng)的烘箱進(jìn)行了比較。簡(jiǎn)而言之，用移液管將200毫克的營(yíng)養(yǎng)飲料分裝到干凈干燥的10毫升玻璃瓶中，然后加入2毫升含1%苯酚(w/v)的6N HCl。然后用氮?dú)鈱?duì)玻璃瓶進(jìn)行吹掃，迅速密封，然后放入110°C的烘箱中進(jìn)行干燥24小時(shí)。色氨酸的分析采用堿水解方案，用4N NaOH代替HCl。Discover Prep微波輔助氨基酸水解反應(yīng)的準(zhǔn)備如下：將200毫克樣品加入裝有蛋形攪拌棒的Pyrex小瓶中。在每個(gè)小瓶中分別定量加入5 mL含有1%苯酚(w/v)的6N HCI或4N NaOH進(jìn)行酸水解或堿水解。用氮?dú)獯祾咝?分鐘然后迅速用Teflon^@內(nèi)襯硅帽密封并放入自動(dòng)進(jìn)樣器架，以便自動(dòng)放入Discover Prep樣品室。Discover Prep AAH方法參數(shù)見表1。完成烘箱和微波反應(yīng)后，冷卻樣品進(jìn)行中和并過濾，以備柱前衍生。所有氨基酸水解物均使用WatersAccQ-Tag™ Ultra衍生試劑盒進(jìn)行衍生處理，然后注入Waters AccQ-Tag Ultra C18色譜柱 (1.7 微米，2.1 x 100 毫米) 進(jìn)行分析，該色譜柱連接Waters Acquity H-Class UPLC，在260納米波長(zhǎng)下進(jìn)行PDA檢測(cè)。⁴

表1. Discover Prep 氨基酸水解參數(shù)

結(jié)果與討論

表2和表3分別顯示了SMART 6和ORACLE得出的總固形物和脂肪結(jié)果。在各種營(yíng)養(yǎng)飲品中，固體含量的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的烘箱干燥法相比，脂肪含量的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的莫瓊尼乙酉迷萃取法相比，都非常好。在所有情況下，無論樣品成分如何，CEM儀器得出的結(jié)果都與傳統(tǒng)方法一致，誤差在0.10%范圍內(nèi)。此外，結(jié)果的精確度也相當(dāng)，所有百分比相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%RSD）均保持在1%以下。

如表4所示，Sprint在分析成人和兒童營(yíng)養(yǎng)飲料時(shí)也表現(xiàn)出色。在這種情況下，Sprint的結(jié)果顯示出比傳統(tǒng)凱氏定氮法更低的%RSD。此外，當(dāng)使用各種蛋白質(zhì)來源 (包括豌豆蛋白、牛奶分離蛋白和乳清蛋白) 配制樣品時(shí)，Sprint也證明是成功的。

表2. 使用SMART 6與傳統(tǒng)烘箱干燥法在各種營(yíng)養(yǎng)飲料中測(cè)定固體百分比結(jié)果的比較

表3. 使用ORACLE與傳統(tǒng)莫瓊尼乙萃取法在各種營(yíng)養(yǎng)飲料中測(cè)定脂肪百分比結(jié)果的比較

表4. 使用Sprint與傳統(tǒng)凱式定氮法在各種營(yíng)養(yǎng)飲料中測(cè)定蛋白質(zhì)百分比結(jié)果的比較

對(duì)于氨基酸水解，選擇了一種巧克力和香草成人營(yíng)養(yǎng)飲料進(jìn)行分析。樣品經(jīng)過酸和堿的水解處理，以準(zhǔn)備LC-UV分析18種氨基酸。使用Discover Prep微波反應(yīng)器獲得的結(jié)果在準(zhǔn)確性和精度方面與傳統(tǒng)的烤箱水解相當(dāng)，得到的回收率在80%到120%之間（圖1和圖2）。

圖1. 巧克力營(yíng)養(yǎng)飲料中18種氨基酸的水解回收率

圖2. 香草營(yíng)養(yǎng)飲料中18種氨基酸的水解回收率

3 結(jié)論

消費(fèi)者對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)注顯著影響著全球產(chǎn)品的生產(chǎn)、監(jiān)管和分銷。這與嚴(yán)格的法規(guī)要求相結(jié)合，突顯了對(duì)高效、可靠和強(qiáng)大的成分分析方法的研究需求日益增長(zhǎng)。傳統(tǒng)的成分分析方法通常耗時(shí)較長(zhǎng)，需要數(shù)小時(shí)，并且需要使用腐蝕性化學(xué)品。相比之下，SMART 6、ORACLE和Sprint等儀器能夠更高效地分析營(yíng)養(yǎng)飲料的總固體、脂肪和蛋白質(zhì)含量。Discover Prep被成功用于制備各種營(yíng)養(yǎng)飲料，以進(jìn)行LC-UV分析18種氨基酸。在準(zhǔn)確性和精度方面，Discover Prep與傳統(tǒng)的烤箱水解方法相當(dāng)。CEM儀器套件的其他關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)包括易于使用的軟件和更安全的實(shí)驗(yàn)室協(xié)議，同時(shí)保持準(zhǔn)確性和精度。

引用

1 Otles, S., Ozyurt, V.H. Classical Wet Chemistry Methods. In Handbook of Food Chemistry.; Springer, 2014; pp 1-14.

2 Chen, P.-K.; Rosana, M. R.; Dudley, G. B.; Stiegman, A. E. Parameters Affecting the Microwave-Specific Acceleration of a Chemical Reaction. J. Org. Chem. 2014, 79 (16), 7425-7436.

3 Dudley, G. B.; Richert, R.; Stiegman, A. E. On the existence of and mechanism for microwave-specific reaction rate enhancement. Chem. Sci. 2015, 6, 2144-2152.

4 Hong, P.; Johnson, D.; Trinite, D. A.; Warren, B.; Zhang, N Hydrolysis and Analysis of Amino Acids from Purified Peptides/Proteins, Foods, and Feeds; Waters Corporation, 2019.Teflon® is a registered trademark of the DuPont Corporation,now Chemours.AccQ-Tag™ is a trademark of Waters Corporation.