環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年由T.  Notomi等人研發(fā)出來的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。它的特點(diǎn)是能夠在恒溫條件下完成對(duì)DNA片段的擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)的目的。這篇文章通過卡通的表現(xiàn)方式來解析LAMP的擴(kuò)增原理。


01 DNA及其擴(kuò)增的幾個(gè)基本規(guī)則

1.DNA雙鏈的互補(bǔ)性與方向性：
自然界的大多數(shù)DNA都以雙鏈形式存在：正負(fù)配對(duì)，就像一對(duì)磁鐵。而且正負(fù)鏈的方向相反，一個(gè)從左往右，一個(gè)從右往左。DNA鏈的序列稱為一級(jí)結(jié)構(gòu)，正負(fù)鏈之間會(huì)形成很多氫鍵（虛線）來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，形成“二級(jí)結(jié)構(gòu)”。而圖2中的DNA單鏈自身就會(huì)通過序列互補(bǔ)形成“啞鈴”型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

                     圖1：DNA雙鏈和正負(fù)鏈通過氫鍵（虛線）結(jié)合，1234都是鏈中任意的序列
 

                                                圖2：DNA一級(jí)序列通過互補(bǔ)配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.DNA擴(kuò)增需要“引物”，且只能延一個(gè)方向擴(kuò)增：
引物是人工合成的可以和長(zhǎng)DNA鏈互補(bǔ)的短序列，目的是實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。DNA擴(kuò)增的這種特性主要由DNA聚合酶決定。DNA聚合酶——無論是PCR中的Taq酶，還是LAMP中的Bst酶，都需要識(shí)別引物來開始序列擴(kuò)增。引物的末端有暴露的-OH羥基，是DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)之一。聚合酶會(huì)在引物后端按照模板互補(bǔ)擴(kuò)增，直至無鏈可擴(kuò)。為了方便起見，本文中所有結(jié)合了DNA聚合酶并且可以擴(kuò)增的唯一方向都用紅色箭頭表示，且當(dāng)擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，紅色箭頭會(huì)變?yōu)槠胀ǖ哪┒�，不能繼續(xù)延伸。

                                            圖3 引物、DNA聚合酶和擴(kuò)增方向（√符號(hào)示意）

3.Bst DNA聚合酶的“鏈置換活性”：
氫鍵是一種可強(qiáng)可弱的相互作用力，在高溫時(shí)會(huì)斷開，降溫時(shí)會(huì)穩(wěn)定，而LAMP的反應(yīng)溫度則處于兩者之間（65℃），因此LAMP反應(yīng)中的氫鍵理論上處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。LAMP中使用的Bst DNA聚合酶具有很強(qiáng)的“鏈置換活性”，兩條鏈之間氫鍵可能會(huì)在斷開后立馬和其它鏈形成新的氫鍵（圖4）


                                                                  圖4 Bst聚合酶的鏈置換活性


02“啞鈴型”核酸結(jié)構(gòu)開始的LAMP擴(kuò)增
 

2.1臨床檢查

現(xiàn)在我們就可以來看看LAMP是如何通過巧妙的設(shè)計(jì)來完成等溫?cái)U(kuò)增。與大多數(shù)敘述LAMP的文章不同，本文直接從LAMP擴(kuò)增最關(guān)鍵的“啞鈴型”核酸入手，將它作為起點(diǎn)，來分解LAMP的擴(kuò)增原理。筆者自制了反應(yīng)過程中的中間結(jié)構(gòu)（.5與.75結(jié)構(gòu)）以幫助理解。

這個(gè)“啞鈴型”核酸就是剛才見過的自帶雙環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，它的兩端可以自身配對(duì)，這種結(jié)構(gòu)恰恰就自帶引物結(jié)構(gòu)，提供擴(kuò)增的起始位點(diǎn)（圖5）。


                                                圖5 啞鈴型核酸以自身為模板的擴(kuò)增（1）→（2）



LAMP中并不是沒有引物，但它的引物有雙重作用，其中之一就是與結(jié)構(gòu)（2）中存在的單環(huán)結(jié)合完成擴(kuò)增形成結(jié)構(gòu)（3）（圖6）。

                   圖6 結(jié)構(gòu)（2）→（3）：（2.5）隨著下方鏈的擴(kuò)增、上方的鏈會(huì)逐漸解離，

                                                   并在解離完成后自身形成環(huán)結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)（3）自身又自帶引物，可以擴(kuò)增為結(jié)構(gòu)（4）（圖7）。在結(jié)構(gòu)（4）產(chǎn)生的同時(shí)，也會(huì)釋放出一條結(jié)構(gòu)（4*），它也是可以形成啞鈴型結(jié)構(gòu)核酸分子，從而可以同步獨(dú)立完成從結(jié)構(gòu)（1）~結(jié)構(gòu)（4）的擴(kuò)增。

                                                 圖7 結(jié)構(gòu)（3）→（4），并形成一個(gè)新的啞鈴結(jié)構(gòu)分子
 

結(jié)構(gòu)（4）上的單環(huán)又可以和體系中的另一個(gè)引物結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)（5）（圖8）。以此類推，之后的結(jié)構(gòu)會(huì)變得較為復(fù)雜，感興趣的朋友可以參考T. Notomi等人發(fā)表的原文獻(xiàn)插圖。相信有本文的引導(dǎo)，看懂他們的插圖應(yīng)該不成問題。

啞鈴型結(jié)構(gòu)的DNA每進(jìn)行3次擴(kuò)增就會(huì)額外形成一個(gè)新的啞鈴型結(jié)構(gòu)，且原結(jié)構(gòu)會(huì)繼續(xù)延長(zhǎng)，最后形成若干首尾相連的“菜花型”結(jié)構(gòu)，并在此過程中同時(shí)產(chǎn)生新的可以獨(dú)立擴(kuò)增的額外模板，目標(biāo)DNA會(huì)指數(shù)擴(kuò)增到檢測(cè)限。

由此可見，LAMP擴(kuò)增的最終產(chǎn)物是一堆長(zhǎng)短不一的混合物，這注定了LAMP只能用于檢測(cè)，而不能用于基因克隆。但LAMP擴(kuò)增使用到4~6個(gè)引物，大大增加了擴(kuò)增的特異性。更多的應(yīng)用可以在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）簡(jiǎn)介一文中閱讀。

                                                                     圖8 結(jié)構(gòu)（4）→（5）

最后，留給大家一個(gè)思考題（看圖9參考）：上面說到，圖6和圖8中出現(xiàn)的引物1和2有雙重的作用，那么它們的第一個(gè)作用就是在任意DNA序列上構(gòu)建出最為關(guān)鍵的啞鈴型結(jié)構(gòu)，這是怎么實(shí)現(xiàn)的呢？有了它，幾乎任意DNA序列都可以用LAMP的方法來擴(kuò)增了。

                                                  圖9 任意DNA序列+引物→啞鈴型結(jié)構(gòu)

附：可使用到的耐思產(chǎn)品

 PCR管 

 移液槍頭