【BioSpherix間歇性高低氧培養(yǎng)箱】

“我們”服務(wù)于睡眠呼吸暫停綜合征研究 

睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS），是指睡眠時(shí)，由于上呼吸道的狹窄或者塌陷造成的睡眠時(shí)呼吸低通氣或者呼吸停頓，長期患病者可以導(dǎo)致高血壓、冠心病、糖尿病等一系列的綜合癥。它分為阻塞型、中樞型和混合型三大類，以阻塞性最多見。

 

近期北京市的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)鼾癥的患病率為 13.4%。其中隨著年齡增加，患病率不斷上升，61-70 歲的鼾癥患病率達(dá)到 23.6%。而睡眠呼吸暫停的患病率為 3.1%。美國有學(xué)者認(rèn)為 60 歲以上鼾癥的患病率為 50%，美國成人男性睡眠呼吸暫停發(fā)病率為 9%，女性 4%。想想我們身邊的人，五個(gè)人中可能就有一個(gè)OSA的患者。

睡眠呼吸暫停綜合征的危害是多方面的，對人體的影響也是系統(tǒng)性的：包括心血管系統(tǒng)中高血壓、心律失常等；內(nèi)分泌中胰島素抵抗、糖代謝異常等；誘發(fā)呼吸衰竭、加重哮喘，還可引起難治性的慢性咳嗽、肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞，甚至肺間質(zhì)疾病等。病人表現(xiàn)為注意力下降、認(rèn)知功能下降，出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒癥狀。

人們對OSAS慢性間歇性缺氧的探索從未中斷，下面我們一起來看兩篇針對此方向的深入研究。

案例一 

Delayed Neutrophil Apoptosis in Patients with Sleep Apnea

期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine(IF=21.405)

摘要：以間歇性缺氧/復(fù)氧（IHR）為特征的阻塞性睡眠呼吸暫停（OSAS）與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。中性粒細(xì)胞（PMN）通過在PMN與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用中產(chǎn)生氧化自由基和蛋白水解酶參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。一般來說，缺氧促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，與其他細(xì)胞不同，在中性粒細(xì)胞中，缺氧嚴(yán)重抑制細(xì)胞凋亡。

方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測全血中性粒細(xì)胞凋亡和粘附分子的表達(dá)，并通過各種培養(yǎng)條件和形態(tài)學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，將全血和純化的中性粒細(xì)胞暴露于IHR和體外持續(xù)缺氧中。 

將全血或純化的中性粒細(xì)胞暴露于三到六個(gè)周期的間歇性缺氧中。空氣相設(shè)定值包括35分鐘的缺氧期，然后25分鐘的復(fù)氧（21%O2和5%CO2），使用BioSpherix Oxycler C42系統(tǒng)（BioSpherix，Redfield，NY）。在每個(gè)1小時(shí)的周期中，實(shí)際血氧飽和度分別保持在2%或6%，持續(xù)時(shí)間為6.6, 6 ,3.6分鐘或6.55, 6, 2.75分鐘。持續(xù)缺氧（SH）的持續(xù)時(shí)間相同（血液中實(shí)際含氧量的2%）。對照組治療后的血液在常氧條件下維持相同的時(shí)間。浸入血液中的氧電極連續(xù)監(jiān)測溶解氧濃度。

 

圖1.與常氧相比，間歇性缺氧/復(fù)氧（IHR）和持續(xù)缺氧（SH）對健康受試者多形核白細(xì)胞（PMN）凋亡測量的體外影響。（A） 流式細(xì)胞術(shù)檢測全血中性粒細(xì)胞中粘附分子CD16的低表達(dá)。（B） 經(jīng)熒光DNA結(jié)合染料Hoechst 33342染色的純化中性粒細(xì)胞的細(xì)胞自旋制備的代表性顯微照片，顯示染色質(zhì)凝聚和凋亡小體的明亮熒光。與常氧相比，SH中的熒光較低，IHR處理的PMN中的熒光最低。（C） 經(jīng)May Grunwald Giemsa染色的純化中性粒細(xì)胞的細(xì)胞自旋制備的典型顯微照片。凋亡的中性粒細(xì)胞通過密集的染色質(zhì)凝聚來鑒定，要么是單個(gè)核，要么是核碎片。細(xì)胞凋亡在常氧狀態(tài)下最高，在IHR狀態(tài)下較低。在IHR治療中，將血樣（A）或純化的中性粒細(xì)胞（B、C）暴露于六個(gè)周期。每個(gè)周期持續(xù)一小時(shí)。在缺氧期間，實(shí)際血液O2濃度為2%，持續(xù)時(shí)間為6.6-3.6分鐘。在常氧期間，血液O2在14.0 6 1.5分鐘內(nèi)恢復(fù)到15%以上。在SH治療中，整個(gè)期間實(shí)際血液或介質(zhì)O2濃度保持在2%。對照組在常氧條件下（21%O2，5%CO2與N2平衡）維持相同的時(shí)間。在所有處理中，二氧化碳保持不變（5%）。

 

 

圖2.睡眠呼吸暫停中白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用示意圖。在常氧條件下，白細(xì)胞在血流中自由流動(dòng)，內(nèi)皮細(xì)胞處于非激活狀態(tài)。然而，粘附分子的基本水平在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面以低水平表達(dá)。

主要結(jié)論：本研究首次證明，在中重度OSAS患者中，PMN凋亡延遲。凋亡的中性粒細(xì)胞百分比與OSAS嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；OSAS中性粒細(xì)胞凋亡減少，粘附分子表達(dá)增加。雖然粘附分子可能促進(jìn)PMN與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的增加，但凋亡的減少可能進(jìn)一步增強(qiáng)這些相互作用，促進(jìn)自由基和蛋白水解酶的釋放；OSAS患者中性粒細(xì)胞凋亡減少，粘附分子表達(dá)增加。白細(xì)胞與延遲的中性粒細(xì)胞凋亡共同對OSAS患者的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化威脅，可通過鼻持續(xù)氣道正壓通氣有效治療。

案例二

bnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway.

 

期刊：Molecular Medicine

摘要：慢性間歇性低氧(CIH)導(dǎo)致認(rèn)知障礙的機(jī)制尚不清楚。但在這里，我們的研究發(fā)現(xiàn)，約3個(gè)月的CIH治療誘導(dǎo)C57BL/6小鼠海馬神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞中的脂滴(LDs)積聚，并引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，包括神經(jīng)元損傷、成神經(jīng)細(xì)胞(NB)凋亡和異常的膠質(zhì)細(xì)胞活化。也就是說OSAS造成的CIH，可引起嚴(yán)重的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，與海馬形態(tài)學(xué)的區(qū)域性改變有關(guān)；脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致行為功能障礙。

方法：SMND-309提取自丹參。給藥后可在大鼠腦中檢測到其為丹酚酸B的新代謝產(chǎn)物.研究證明309通過抗凋亡、抗炎和抗氧化作用促進(jìn)神經(jīng)元存活。在這項(xiàng)研究中，SMND-309被腹膜內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)，以減輕CIH引起的神經(jīng)損傷。這可能有助于開發(fā)潛在的治療OSAS的藥物靶點(diǎn)。

CIH：

小鼠每天從上午8:00到下午4:00暴露在CIH/室內(nèi)空氣(RA)條件下，持續(xù)約3個(gè)月。在暴露期間，將WT + CIH組和SMND-309 + CIH (3-FP + CIH)組中的小鼠放入CIH室(BioSpherix OxyClycler A84，美國)，將WT + r A組和SMND-309 (3-FP)組放入RA室(BioSpherix OxyClycler A84，美國)。首先，這個(gè)小室充滿了氮?dú)獬掷m(xù)85-95秒，氧氣水平從21%±1%(正常)降至7%±1%(缺氧)。然后，氧氣水平在15-20秒內(nèi)保持在7%±1%。最后，氧氣水平在45-50秒內(nèi)恢復(fù)到21%±1 %,并持續(xù)15-20秒。CIH循環(huán)持續(xù)約180秒，每小時(shí)約20個(gè)循環(huán)。RA艙內(nèi)的氧氣水平始終保持在21%±1%。

IH：

通過在安裝在培養(yǎng)箱內(nèi)的氧氣控制柜(Biospherix Oxycycler C42)中培養(yǎng)細(xì)胞來誘導(dǎo)IH，該氧氣控制柜配備有用于連續(xù)監(jiān)測氧氣水平的氧氣傳感器。氮氧和5%二氧化碳的混合物輸注，氧水平包括30分鐘的低氧期(3% O2)，隨后是30分鐘的復(fù)氧期(21% O2).實(shí)際O2在每個(gè)1小時(shí)的循環(huán)中，飽和度保持在3% 10分鐘，進(jìn)行3天。

圖3.SMND-309的研究過程和結(jié)構(gòu)。A.研究工作流程。在7天的適應(yīng)后，小鼠暴露于CIH條件下約3個(gè)月，并在最后一周用SMND-309治療。CIH暴露結(jié)束后，立即進(jìn)行行為測試。B.CIH治療計(jì)劃。紅線代表設(shè)定點(diǎn)。藍(lán)線代表實(shí)際的含氧量。C.SMND-309的結(jié)構(gòu)

 

圖4.DG區(qū)的病理變化。A.海馬的H&E染色。在WT + CIH組的SGZ中，幾乎沒有觀察到NBs(白色箭頭)，但是SMND-309治療減輕了損傷。原始放大倍數(shù):400倍。B.海馬的透射電鏡結(jié)果。WT + CIH組的神經(jīng)元表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)空泡化、LDs積聚(黑色箭頭)和線粒體破裂(黑色三角形)。此外，WT + CIH組的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)水腫(黑星)，尤其是在血腦屏障周圍區(qū)域。原始放大倍數(shù):15000倍。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

主要結(jié)論：SMND-309是丹參，已應(yīng)用于神經(jīng)保護(hù)，SMND-309治療通過減少DG區(qū)神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中LDs的積累來改善CIH小鼠的行為表現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于提供一種新的潛在的神經(jīng)保護(hù)療法。在這項(xiàng)研究中，CIH誘導(dǎo)的海馬損傷是由NBs、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中LDs的積累觸發(fā)的。LDs的產(chǎn)生可通過JNK/SREBP/ACC途徑調(diào)節(jié)。SMND-309治療減輕了這些損傷。迄今為止，LDs在神經(jīng)細(xì)胞中的作用仍有爭議。脂質(zhì)合成障礙和LDs異常積聚機(jī)制仍不清楚。所有這些問題都需要進(jìn)一步研究。

在對OSAS的研究中，無論是以細(xì)胞還是動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)建模對象，都離不開間歇性缺氧這個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，在兩份研究中，能精準(zhǔn)控制中性粒細(xì)胞和小鼠缺氧暴露時(shí)間與濃度的設(shè)備，都是來自Biospherix的產(chǎn)品：

01 OxyCycler C42高級動(dòng)態(tài)可編程氧氣控制系統(tǒng)

 

動(dòng)態(tài)雙通道/雙氣體控制器�？赏瑫r(shí)連接兩個(gè)C-chamber,各自獨(dú)立編程。

動(dòng)態(tài)氧氣編程，氧氣設(shè)置0.1-99.9%，二氧化碳設(shè)置0.1-20.0%

外接CO₂、N₂和O₂三個(gè)氣瓶，輕松實(shí)現(xiàn)急性高氧/缺氧、慢性缺氧和高/低氧交替控制

可同時(shí)獨(dú)立編程控制兩個(gè)腔室的氣體濃度曲線

通過電腦軟件，可預(yù)編程和存儲不同的氣體濃度升降位點(diǎn)、持續(xù)時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)，實(shí)時(shí)記錄和存儲氣體濃度等數(shù)據(jù)。

02 OxyCycler A840V動(dòng)態(tài)編程氧氣控制系統(tǒng)

 

可動(dòng)態(tài)設(shè)定氧氣濃度（0.1-99.9%），可同時(shí)控制4個(gè)動(dòng)物籠,，獨(dú)立運(yùn)行不同的程序

可以輕松完成程序式低氧/高氧控制

可快速達(dá)到氧氣濃度設(shè)定值，并循環(huán)程序1-999次或無限

可選配監(jiān)控器，快速檢測到氣體濃度中斷并及時(shí)修正

電腦操作界面，實(shí)時(shí)記錄探頭反饋數(shù)據(jù)，顯示趨勢圖表

參考文獻(xiàn)：

【1】Dyugovskaya L, Polyakov A, Lavie P, Lavie L. Delayed neutrophil apoptosis in patients with sleep apnea. Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):544-54. doi: 10.1164/rccm.200705-675OC. Epub 2007 Nov 15. PMID: 18006889.

【2】Li, D., Xu, N., Hou, Y. et al. Abnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway. Mol Med 28, 3 (2022). https://doi.org/10.1186/s10020-021-00427-8

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