熒光抗體是將抗血清，經(jīng)純化成抗體IgG成分，采用直接標記方法，將異硫氰酸熒光素（FITC美國sigma產(chǎn)品）及異硫氰酸羅達明熒光素（紅色）（RBITC, sigma產(chǎn)）共價交聯(lián)到抗體（IgG）分子的賴氨酸分子上，并經(jīng)過純化、蛋白量、FITC、RBITC濃度及效價鑒定而制成。免疫學(xué)實驗中，我們經(jīng)常需要將抗體標記上酶或者熒光素，大部分科研工作者如何下手，參照一些文獻的方法和步驟做出來的結(jié)果往往不盡如人意，往往讓實驗人員畏而束手。
                        
下面總結(jié)了抗體的標記一些小技巧：
第一，你需要了解你所需要的標記物的特性，選擇合適的帶活性標記物（HRP酶，生物素或者熒光染料），對活性的標記物要清楚其溶解性(脂溶性還是水溶性)、保存要求、活性位點化學(xué)反應(yīng)特性等等。有些熒光染料有較為苛刻的要求，一定要防潮，一旦遇到水活性鍵在幾分鐘內(nèi)或幾小時內(nèi)完全失活，脂溶性的染料一般用DMSO,DMF類有機溶劑溶解，一定要確保其不含水分。在保存上所有熒光染料都要求避光，使用和反應(yīng)過程都要盡量避光�；钚匀玖系幕钚枣I與抗體的反應(yīng)基團必須要清楚，這樣才能保證給其提供最適宜的反應(yīng)條件。

第二，關(guān)于抗體�？贵w的純度要好，特異性和溶解性也要好，盡量不要有變性抗體和沉淀物。其溶解的溶液環(huán)境最好為無機鹽(比如PBS環(huán)境)，處于一個合適穩(wěn)定的PH環(huán)境，溶液中不含有游離的可干擾反應(yīng)的官能團，比如，大部分的活性染料是與抗體的伯氨基（-NH2）反應(yīng)，所以溶液中一定不能含有帶伯氨基的化學(xué)物質(zhì)(比如游離的氨基酸，游離肽，或者Tris之類的)，我們純化抗體過程需要大量使用這些試劑，在后期往往沒有去除干凈。也許有的小伙伴會說，我用PBS透析了很多次；其實透析次數(shù)不能說明問題，也不能說明你就一定透析干凈；怎么辦呢？加個標準參照，一些非活性的染料都可以作為參照指示劑，實在找不到合適的染料，加點藍墨水也可以，一般來說如果可以精確計算，顏料的摩爾數(shù)是預(yù)除去小分子的20倍為宜，透析或者超濾到看不到顏色，這個基本上可以保證您對游離小分子去除干凈。

第三，標記反應(yīng)過程，標記反應(yīng)的條件要是最適合于標記物化學(xué)反應(yīng)的，而于此同時又不能損傷抗體的活性。對于標記緩沖液中同樣不能有游離基團或者抑制劑干擾反應(yīng)；標記溫度和時長也要合理控制；標記物與抗體的比例要合適，不是越多越好。整個標記反應(yīng)過程要避光，所使用接觸的所有的容器槍頭一定要干凈。

最后，標記反應(yīng)完之后，殘留的未標記的標記物、有機溶劑一定要去除干凈（去除干凈的標準同抗體溶液環(huán)境中游離干擾物去除方法），同時，PH要調(diào)整到抗體最適的環(huán)境。必要的時候加入30&左右甘油和保護性的蛋白，分裝成小份-20℃保存。