• 樣品偶聯(lián)方案

以下方案旨在為生物分子與帶有不同表面基團(tuán)的微球的偶聯(lián)提供一般指導(dǎo)。但可能還需要進(jìn)行優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)最佳的活性和穩(wěn)定性，同時最大程度地減少非特異性結(jié)合特性。
A. 羧基修飾的微球試劑：
1. 羧基修飾的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 活化緩沖液（pH 4.5-7.5）*（MES緩沖液是常見選擇）。
3. 偶聯(lián)緩沖液（pH 7.2-8.5）[應(yīng)避免使用含有游離胺的緩沖液，例如Tris或甘氨酸。]
4. 水溶性碳二亞胺（WSC）[例如 EDC，CMC等] **
5. 蛋白質(zhì)或其他生物分子
6. 用30-40 mM的伯胺源淬滅溶液[例如 羥胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻斷分子
7. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的活化緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。***
2. 第二次洗滌后，將沉淀重懸于10mL的活化緩沖液中，確保微球懸浮良好。 （渦旋，超聲處理或滾動應(yīng)有助于重懸。）注意：微球懸浮液的濃度現(xiàn)在為10 mg / mL。
3. 混合時，加入100mg的WSC。 （添加WSC可能會導(dǎo)致結(jié)塊；通常不會引起太大的關(guān)注，應(yīng)該通過與生物分子孵育來解決[步驟6-7]。）
4. 在室溫（18-25°C）下反應(yīng)15分鐘，并連續(xù)攪拌。
5. 在偶聯(lián)緩沖液中洗滌2次，并重懸于5mL的相同緩沖液中。像步驟2中一樣，盡可能確保顆粒被很好地懸浮。
6. 在5mL偶聯(lián)緩沖液中溶解蛋白質(zhì)（超出計算的單層1-10倍）。結(jié)合微球懸浮液和蛋白質(zhì)溶液。
7. 在室溫下持續(xù)攪拌2-4小時。
8. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，并輕輕混合30分鐘。洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
9. 存放在4℃直到使用。
* 加入WSC后的反應(yīng)速率取決于pH（隨著pH降低，反應(yīng)速率增加）。
**  EDAC或EDC：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
Hydrochloride
CMC：1-Cyclohexyl-2-(2-morpholinoethyl) carbodiimide
Metho-p-toluenesulfonate
備擇方案：
1. 一步耦合反應(yīng)，即碳二亞胺，蛋白質(zhì)和微球在一個步驟中結(jié)合在一起，對于耦合較大的分子通常是有問題的，但已有效地用于較小的分子（如類固醇和半抗原）的耦合。
2. 可以加入水溶性的磺基-N-羥基琥珀酰亞胺以提高偶聯(lián)效率。 由N-羥基化合物形成的活性酯中間體替代由WSC形成的鄰酰基脲脲中間體（不穩(wěn)定），對水解更穩(wěn)定，但仍對要偶聯(lián)的蛋白質(zhì)上的胺具有高反應(yīng)性。
B. 氨基修飾的微球
試劑：
1. 氨基修飾的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 胺反應(yīng)性同雙功能交聯(lián)劑（例如戊二醛，酰亞胺酯或NHS酯。）
3. 洗滌/偶聯(lián)緩沖液（pH 6.0-9.0）（請參見第二部分，緩沖液。）
4. 蛋白質(zhì)或其他生物分子
5. 用30-40 mM的伯胺源淬滅溶液[例如 羥胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻斷分子
6. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗滌/偶聯(lián)緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗滌后，將沉淀重懸于10mL戊二醛溶液中（戊二醛溶解在洗滌/偶聯(lián)緩沖液中至終濃度10％）*，確保微球完全懸浮。 （渦旋，超聲處理或滾動就足夠了。）注意：微球懸浮液的濃度現(xiàn)在為10 mg / mL。
3. 在室溫（18-25°C）下反應(yīng)1-2小時，并持續(xù)攪拌。
4. 洗滌2次，重懸于5mL洗滌/偶聯(lián)緩沖液中，并確保將顆粒完全重懸，如步驟2所示。
5. 在5mL洗滌/偶聯(lián)緩沖液中溶解蛋白質(zhì)（超出計算的單層1-10倍）。結(jié)合微球懸浮液和蛋白質(zhì)溶液。
6. 在室溫下連續(xù)攪拌2-4小時。
7. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，并輕輕混合30分鐘。洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
8. 存放在4℃直到使用。
*戊二醛應(yīng)大量添加，以使微球上的氨基飽和，從而避免在配體連接之前微球之間的交聯(lián)。 添加的數(shù)量需要優(yōu)化，因?yàn)槲於�醛過多可能會改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，從而降低其生物活性。
備擇方案：
1. 除戊二醛外，各種長度的胺反應(yīng)性同雙功能交聯(lián)劑都可用于形成間隔臂，從而使共價偶聯(lián)的蛋白質(zhì)從表面上以不同的長度引出。
2. 氨基和醛之間形成的鍵形成可逆的席夫堿，必須通過稱為還原烷基化的方法將其還原，以使鍵共價。 常用的還原劑包括氰基硼氫化鈉，胺硼烷和吡啶硼烷。但是，由于每種蛋白質(zhì)上的幾個氨基都與微球上的醛基相互作用，因此有時認(rèn)為在偶聯(lián)大多數(shù)蛋白質(zhì)時無需還原這些鍵，例如抗體。
C. 羥基修飾的微球
試劑：
1. 羥基改性的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 2 M碳酸鈉（活化緩沖液）
3. 氰化溴化物（CNBr）
4. 乙腈（C₂H₃N）[用于溶解CNBr]
5. 蛋白質(zhì)或其他生物分子
6. 洗滌/偶聯(lián)緩沖液（pH 8.0-9.0）。 （避免使用含胺的緩沖液，如Tris或甘氨酸，它們會與配體競爭偶聯(lián)位點(diǎn)。 請參見第二節(jié)，緩沖液。）
7. 用30-40 mM的伯胺源淬滅溶液。 （羥胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）的阻斷分子。
8. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗滌/偶聯(lián)緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次清洗后，重懸于9.5mL的活化緩沖液中，確保微球完全懸浮。 （渦旋，超聲處理或滾動就足夠了。）
3. 在通風(fēng)櫥中，將1g CNBr（或1g CNBr：100mg微球的比例）溶解在0.5mL乙腈中。 （警告：CNBr具有很高的危險性，應(yīng)在通風(fēng)櫥中使用所有適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施進(jìn)行處理。）
4. 將CNBr溶液（滴加）添加到攪拌的微球懸浮液中，并使活化反應(yīng)在室溫（18-25°C）下精確地持續(xù)2分鐘。注意：微球懸浮液的濃度現(xiàn)在為10 mg / mL。
5. 在大量的冰冷水中快速洗滌活化的微球，然后用冷偶合緩沖液洗滌。 5mL冷偶合緩沖液（4˚C）重懸微球。將要偶聯(lián)的配體溶解在5mL偶聯(lián)緩沖液中，其濃度對應(yīng)于計算出的單層1-10X過量，結(jié)合微球懸浮液和蛋白質(zhì)溶液。
6. 在持續(xù)攪拌下，將懸浮液在4°C下保持24小時。
7. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，并輕輕混合30分鐘。洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
8. 存放在4℃直到使用。
備擇方案：
1. 1-cyano-4-dimethylaminopryidinium tetrafluoroborate可以代替CNBr，因?yàn)樗�是不揮發(fā)的，毒性較小的化學(xué)藥品，具有較長的半衰期。
2. 也可以使用Tosyl Chloride, Tresyl Chloride or carbonyl diimidazole活化劑代替溴化氰。
D. 酰肼修飾的微球
試劑：
1. 酰肼改性的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 洗滌/偶聯(lián)緩沖液（pH 5.0-7.0）
3. 蛋白質(zhì)
4. 100 mM偏高碘酸鈉（NalO₄）
5. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
A. 蛋白質(zhì)的氧化（注意：該反應(yīng)對光敏感，應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。）
1. 在1mL的洗滌/偶聯(lián)緩沖液中溶解或稀釋1-10X過量的計算的單層蛋白質(zhì)。
2. 將蛋白質(zhì)溶液添加到含有1mg偏高碘酸鈉的琥珀色小瓶中：20mg蛋白質(zhì)； 輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解氧化劑。
3. 不斷攪拌下，將樣品在室溫下孵育30分鐘。
4. 通過使混合物通過用偶聯(lián)緩沖液平衡的脫鹽柱（例如Sephadex™G25或PD10）終止反應(yīng)并除去未反應(yīng)的NalO₄。
B. 偶聯(lián)至肼修飾的乳膠微球
1. 在10mL的洗滌/偶聯(lián)緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗滌后，將微球重懸于9mL洗滌/偶聯(lián)緩沖液中，確保微球完全懸浮。
3. 將9mL的微球懸浮液與1mL的氧化蛋白質(zhì)懸浮液混合。 （注意：現(xiàn)在濃度為10 mg / mL。）在室溫（18-25°C）下混合至少反應(yīng)6個小時。
4. 洗滌，重懸于含有0.05-1％（w / v）阻斷分子的10mL洗滌/偶聯(lián)緩沖液中，輕輕混合30分鐘。
5. 洗滌，然后重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
6. 儲存在4℃直到使用。
備擇方案：
另一種選擇是使用戊二醛激活微球，使用的方法與氨基修飾的微球相同。​
E. 氯甲基修飾的微球
試劑：
1. 氯甲基改性的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 蛋白質(zhì)或其他生物分子
3. 洗滌/偶聯(lián)緩沖液（pH 7.5）
4. 用30-40 mM（例如羥胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）阻斷分子的伯胺源淬滅溶液。
5. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗滌/偶聯(lián)緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗滌后，重懸于5mL洗滌/偶聯(lián)緩沖液中，確保微球完全懸浮。 （渦旋，超聲處理或滾動就足夠了。）
3. 在5mL洗滌/偶聯(lián)緩沖液中溶解蛋白質(zhì)（超出計算的單層1-10倍）。 結(jié)合微球懸浮液和蛋白質(zhì)溶液。注意：微球懸浮液的濃度現(xiàn)在為10 mg / mL。
4. 在室溫（18-25°C）下持續(xù)攪拌2-4小時。
5. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，在室溫下輕輕混合30分鐘。
6. 洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
7. 存放在4℃直到使用。
注意：氯甲基微球可以分類為預(yù)活化的，因?yàn)槲⑶蛏系穆燃谆鶗�直接與可用的氨基反應(yīng)，而無需任何預(yù)處理步驟。 由于這些氯甲基的高反應(yīng)性，它們會隨著時間的推移在水性懸浮液中脫鹵化氫，因此合成后的保存期限有限。 然而，一旦配體被偶聯(lián)，它們的穩(wěn)定性就與任何其他配體包被的微球的穩(wěn)定性相匹配。

其它偶聯(lián)方案
A. 與非功能化聚合物微球的偶聯(lián)

1. 聚苯乙烯（PS）

可以通過四個步驟將生物分子共價偶聯(lián)到普通的聚苯乙烯微球上：表面苯乙烯環(huán)的硝化； 硝基轉(zhuǎn)化為芳族胺基； 芳族胺基團(tuán)的重氮化形成重氮化合物； 并與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基偶聯(lián)。

1. 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）

PMMA微球并未廣泛用于配體的共價偶聯(lián)； 然而，甲酯基將容易與肼反應(yīng)，產(chǎn)生酰肼反應(yīng)位點(diǎn)。
B. 與非功能化二氧化硅微球的偶聯(lián)
已有文獻(xiàn)報道了硅烷化的核酸（寡核苷酸，PCR產(chǎn)物）與未修飾的玻璃表面的偶聯(lián)�？梢詫⑦@種方法進(jìn)行修飾，以將硅烷化的生物分子與二氧化硅微球偶聯(lián)。
C. 表面官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化
可以將微球上的一個表面官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為另一個。例如，胺改性的微球可通過琥珀酸酐反應(yīng)轉(zhuǎn)化為羧基改性的微球；相反，羧基可通過碳二亞胺介導(dǎo)的二胺的連接而轉(zhuǎn)化為胺基；巰基改性的微球可通過胺官能化的微球反應(yīng)制得。這些和其他轉(zhuǎn)化可用于拓寬各種配體的連接方案。
D. 小分子的共價結(jié)合
小分子（半抗原，激素，藥物等）的共價結(jié)合可能會帶來特殊的困難，需要創(chuàng)造性的解決方案，例如載體分子和各種類型的交聯(lián)劑的組合。 可以使用間隔物/交聯(lián)劑從小球的表面延伸小分子，從而減少空間位阻并允許小分子與樣品中的靶分子相互作用。 具有可用表面基團(tuán)（例如BSA，聚賴氨酸）的載體分子可能被吸附到微球表面，隨后小分子與載體分子的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生共價偶聯(lián)。 或者，可以先將小分子與載體分子共價偶聯(lián)，然后將載體/小分子復(fù)合物吸附到微球。 然后可以將吸附的載體分子彼此共價連接，以防止它們從顆粒中解吸/丟失。