圖 1
總 RNA 樣品經(jīng)過不同時間降解，并且在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)上使用真核細(xì)胞總 RNA Nano 分析法分析所得的樣品。隨著降解推進(jìn)，可以觀察到向較短片段大小方向偏移

RIN 可視化
先前版本生物分級軟件中存在的數(shù)據(jù)可以同樣存在于下一版 Expert 軟件中，例如 RNA 面積、RNA 濃度和 rRNA 比率。RIN 軟件包括 RIN 值（圖 4），該值可以表述為小數(shù)或整數(shù)。RIN 值可以在“全局高級”設(shè)置下的“設(shè)點(diǎn)瀏覽器”中的“分析性質(zhì)”選項卡中從小數(shù)變?yōu)檎麛?shù)。如果軟件在某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)意外的峰或信號，可能無法計算 RIN 值。


圖4
Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)Expert 軟件中的RIN 可視化。“結(jié)果”選項卡中顯示 RIN 值， 而“錯誤”選項卡將包含在RIN 未計算情況下有用的信息

這將產(chǎn)生提示已檢測到異常的錯誤 消息（列在軟件的錯誤選項卡中）。異常包括基因組 DNA 污染、鬼峰、尖峰和波浪狀基線。異�？梢苑譃閮深悾宏P(guān)鍵和非關(guān)鍵。非關(guān)鍵異常因素(如后區(qū)的尖峰)仍可以計算 RIN 值，而關(guān)鍵異常（如快速區(qū)的尖峰）將導(dǎo)致 RIN 值無法計算。如果認(rèn)定某個異常非關(guān)鍵（如基因組污染，此事應(yīng)當(dāng)進(jìn)行 DNA 酶消化以獲取有意義的數(shù)據(jù)），對于已經(jīng)標(biāo)記的樣品，仍可以通過在“設(shè)點(diǎn)瀏覽器”的高級設(shè)置中提高異常閾值設(shè)定，計算 RIN 值（圖 5）。異常閾值檢測的最大值為 1。錯誤消息的描述將與適當(dāng)閾值相對應(yīng)。


圖5
改變異常閾值和 RIN 單位小數(shù)表示。如果分析期間已經(jīng)檢測到關(guān)鍵異常，則在許多情況下仍可以通過提高閾值（最大值為 1）計算 RIN 值�？梢栽�“錯誤”選項卡中找到關(guān)于異常的信息

利用 RIN 得到的結(jié)果
開發(fā) RIN 軟件以消除依賴用戶的 RNA 質(zhì)量解釋過程�？� RNA 樣品的表征基本上與儀器、樣品濃度和操作者無關(guān)，從而允許跨不同實(shí)驗(yàn)室比較樣品。

RNA 完整性
圖 6 展示三份完整程度狀態(tài)不同的 RNA 樣品。RIN 工具賦予三種不同命名，代表相應(yīng)的完整性。在樣品與調(diào)試算法時所用樣品不同的大型驗(yàn)證研究期間，得到了可靠的樣品分類。


圖6
在完整程度不同的樣品上檢驗(yàn) RNA 完整值。RIN 軟件算法能夠?qū)�樣品精確分類

核糖體比率
圖 7 顯示了在三臺不同儀器上分析的同一份人腦 (Ambion, Inc.) 總 RNA 樣品，并且顯示了儀器 1 和儀器 3 的代表性電泳圖。將采用生物分析儀軟件生成的核糖體比率與 RIN 值比較。對于 36 份樣品，與 RIN 值相比，采用核糖體比率時變異程度較大。RIN 計算值的變異系數(shù)為 1.4%， 而核糖體比率的變異系數(shù)為 5.1%。謹(jǐn)記這些 CV 值指向相同樣品。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)比較不同來源的物種或組織的樣品時，核糖體比率的CV值顯著增大。


圖7
三臺不同儀器上分析 36 份總 RNA 樣品。將 RIN 與核糖體比率比較。RIN 工具的 CV 顯著低于核糖體比率

不同稀釋濃度的樣品得到的圖像類似(圖8)。將小鼠腦組織的樣品稀釋為以下三個濃度：25ng/μl，100ng/μl和500ng/μl。被測108份樣品中，RIN值顯著大于核糖體比率。RIN 的變異系數(shù)為3%，而核糖體比率的變異系數(shù)則為 22%。應(yīng)當(dāng)指出，低于 25 ng/µL時，不能獲得準(zhǔn)確的 RIN 值。對于大于 50 ng/µL 的樣品濃度，獲得最佳結(jié)果。


圖8
檢驗(yàn)不同稀釋程度的同一份 RNA 樣品時，以狹窄限值范圍獲得相同的RIN  值，而核糖體比率顯示重現(xiàn)性差得多

RIN 的應(yīng)用
RIN 是測量 RNA 完整性的一款強(qiáng)大的新工具。圖 9 中的圖示給出了 RIN 的最佳實(shí)際使用案例。作為第一步，應(yīng)當(dāng)驗(yàn)證 RIN 值（圖 9A）。這可以通過將 RIN 值與特定下游實(shí)驗(yàn)如微陣列分析或 RT-PCR 關(guān)聯(lián)來進(jìn)行�？梢岳�用這個關(guān)聯(lián)步驟在成功的下游實(shí)驗(yàn)和失敗的實(shí)驗(yàn)間建立 RIN 閾值�？梢栽诂F(xiàn)有生物分析儀數(shù)據(jù)集合（如可獲得）上進(jìn)行此步驟。在已經(jīng)建立閾值后，這個值可以用于標(biāo)準(zhǔn) RNA 質(zhì)量控制程序（圖 9B）。RIN 高于閾值的所有樣品通過 QC 檢驗(yàn)，而丟棄 RIN 低于閾值的樣品。如果重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)變更（例如，研究不同的生物、使用不同類型的微陣列、采用不同的探針集等），則應(yīng)當(dāng)重復(fù)驗(yàn)證 RIN 的關(guān)聯(lián)步驟。截至目前，已采用真核生物總 RNA Nano 分析法檢驗(yàn) RIN 算法。


RIN 局限性
RIN 旨在提供明確的 RNA 完整性評估結(jié)果。給出了樣品完整性的衡量標(biāo)準(zhǔn)，它可用于直接比較運(yùn)輸前后的樣品，或用于比較不同實(shí)驗(yàn)室間的樣品。最重要的是，它可以用來確保基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，只要涉及樣品提取步驟。然而，在無前期驗(yàn)證工作的情況下，RIN 不能預(yù)測基因表達(dá)數(shù)據(jù)的效能。例如，一份樣品可能過度降解而無法進(jìn)行全基因組微陣列實(shí)驗(yàn)，但可能產(chǎn)生良好的 RT-PCR 數(shù)據(jù)。為了有效利用RIN，必須進(jìn)行必要的關(guān)聯(lián)工作。

結(jié)論
我們已經(jīng)設(shè)計出一款能夠比核糖體比率更好評估 RNA 質(zhì)量的軟件算法。RIN 工具是 RNA 完整性評估標(biāo)準(zhǔn)化的重要環(huán)節(jié)。研究者不再受困于總 RNA 的主觀分類。通過進(jìn)行關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)，可創(chuàng)建閾值以確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) RIN 工具基本上沒有儀器變異性及濃度變異性， 因此有助于儀器間及實(shí)驗(yàn)室間樣品的比較。

參考文獻(xiàn)
1.“Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribo- green analysis, and UV spectrometry” （采用 Agilent 2100 生物分析儀、RiboGreen 分析試劑和紫外光譜對總RNA進(jìn)行定量比較），安捷倫應(yīng)用簡報，出版號 5988-7650EN, 2002
2.“A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantita- tion”, Electrophoresis, 21(1), 128-34,
2000
3.“Advancing the quality control methodology to asses isolated total RNA and generated fragmented cRNA”（通過改進(jìn)質(zhì)量控制方法評估游離總RNA 以及生成的 cRNA 片段，安捷倫應(yīng)用簡報，出版號5988-9861EN, 2003

致謝
我們要特別感謝合作伙伴 Ambion Inc.、德國基因組研究資源中心 (RZPD) 以及 Quantiom Bioinformatics。我們還要特別感謝對 RIN 算法進(jìn)行內(nèi)部測試并提供寶貴意見的所有研究人員。