法參數(shù)的前提下成功地將HPLC方法轉(zhuǎn)換到了現(xiàn)代LC平臺(tái)上。

 

表1. 比較圖1中Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)和ACQUITY Arc系統(tǒng)鑒定出的52個(gè)色譜峰的保留時(shí)間。采用Gradient SmartStart技術(shù)補(bǔ)償兩個(gè)系統(tǒng)之間的延遲體積差異。通過(guò)計(jì)算所得的

 

 

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)室或其它分析場(chǎng)所中部署新的儀器平臺(tái)時(shí)，確保分析結(jié)果的一致性是非常重要的。

為了比較不同ACQUITY Arc系統(tǒng)的分析結(jié)果，我們采用具有相同核心配置的兩套不同的ACQUITY Arc系統(tǒng)，在如上所述的方法條件下執(zhí)行分析并采集了數(shù)據(jù)。這兩套系統(tǒng)都配置了30 cm CH被動(dòng)預(yù)加熱器。每套系統(tǒng)分析時(shí)所采用的流動(dòng)相和樣品都是單獨(dú)制備的，以模仿實(shí)際工業(yè)環(huán)境中不同分析人員在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)執(zhí)行樣品分析的情形。如圖2所示，兩個(gè)系統(tǒng)所得的英夫利昔單抗肽圖具有良好的一致性。評(píng)估兩個(gè)系統(tǒng)的相對(duì)保留時(shí)間差異之后可知，相對(duì)保留時(shí)間的差異不超過(guò)0.006(如表2所示)。采用同一平臺(tái)的兩臺(tái)不同儀器獲得了幾乎相同的結(jié)果，表明了分析結(jié)果的可靠性。

 

圖2. 比較兩套不同的ACQUITY Arc系統(tǒng)獲得的英夫利昔單抗肽圖：A) ACQUITY Arc系統(tǒng)1和B) ACQUITY Arc系統(tǒng)2。實(shí)驗(yàn)計(jì)算了所有標(biāo)記峰的相對(duì)保留時(shí)間。色譜峰的選擇由洗脫位置和強(qiáng)度決定。相對(duì)保留時(shí)間依據(jù)峰1計(jì)算。

 

在常規(guī)的肽監(jiān)測(cè)分析中，我們通常僅使用光學(xué)檢測(cè)技術(shù)測(cè)定樣品的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，然后將這些數(shù)據(jù)與參比標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，用以確定分析結(jié)果是否符合適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)引入ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器作為正交檢測(cè)方法，我們可借助它提供的質(zhì)量數(shù)信息獲得更加可靠的產(chǎn)品一致性分析結(jié)果。為了獲得上述肽圖方法的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，我們?cè)诠鈱W(xué)檢測(cè)器之后串聯(lián)了ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器。本實(shí)驗(yàn)采用了填充小粒徑顆粒的色譜柱，目的是充分利用ACQUITY Arc系統(tǒng)能夠同時(shí)運(yùn)行HPLC和UHPLC分離的優(yōu)勢(shì)。本示例用2.5 μm色譜柱替代了3.5 μm色譜柱。我們并未因色譜柱粒度改變而對(duì)方法進(jìn)行縮放，而是沿用了之前的60分鐘分析方法，這樣可以充分利用小粒徑色譜柱帶來(lái)的分離度和峰容量?jī)?yōu)勢(shì)。

 

表2. 比較圖2中兩套不同ACQUITY Arc系統(tǒng)鑒定出的52個(gè)峰的保留時(shí)間。系統(tǒng)之間的保留時(shí)間差異極小。由計(jì)算的_值可知，相對(duì)保留時(shí)間幾乎一樣。

 

圖3A展示了使用3.5 μm色譜柱在Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)上獲得的色譜圖，以便進(jìn)行比較(另見(jiàn)：圖1A)。圖3B展示了使用2.5 μm色譜柱在ACQUITY Arc系統(tǒng)上獲得的結(jié)果，圖3C展示了相應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)。將色譜柱粒徑由3.5 μm降至2.5 μm，可以觀察到微小的分離度差異。UV/Vis數(shù)據(jù)與相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)高度相關(guān)，表明ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器可應(yīng)用于常規(guī)分析。

 

ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器的引入，能夠在完成色譜峰表征之后為分析人員提供確證鑒定結(jié)果所需的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，幫助他們進(jìn)行批釋放測(cè)試和產(chǎn)品批次間的比較分析。以肽序列ASQFVGSSIHWYQQR為例，粗體部分表示互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。根據(jù)肽的平均質(zhì)量1794.0 Da，我們可計(jì)算出相應(yīng)電荷態(tài)離子[M+1H]+1、[M+2H]+2和[M+3H]+3的質(zhì)量分別為1795.0 Da、898.0Da和599.0 Da。圖4A中光學(xué)積分峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與圖4B中峰頂點(diǎn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)相當(dāng)。我們?yōu)锳CQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器設(shè)定的掃描范圍為350 m/z到最大值1250 m/z。從圖4B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中我們可以觀察到不同電荷態(tài)都可以落在該掃描范圍內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中完成表征之后，進(jìn)一步獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)有助于分析人員對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行確認(rèn)。

 

圖3. 英夫利昔單抗的肽圖對(duì)比，分別采用A) Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)和B) ACQUITY Arc系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，圖C)則為通過(guò)ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器獲得的相應(yīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)時(shí)使用的是填充3.5 μm顆粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱，而ACQUITY Arc 系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)時(shí)使用的是填充2.5 μm顆粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱。相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與光學(xué)數(shù)據(jù)高度相關(guān)。

 

圖4. 來(lái)自ACQUITY Arc系統(tǒng)的英夫利昔單抗肽圖的放大圖，分別展示了A)光學(xué)數(shù)據(jù)以及B)光譜積分峰的相應(yīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采集數(shù)據(jù)時(shí)使用的是填充2.5 μm顆粒的XBridge BEH C18130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱。圖B)中所示的電荷態(tài)分別對(duì)應(yīng)為肽序列ASQFVGSSIHWYQQR(粗體部分代表CDR序列)的[M+1H]+1和[M+2H]+2計(jì)算所得的值。

 

生物制藥行業(yè)已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了應(yīng)用新技術(shù)和新方法的重要性，紛紛向?qū)嶒?yàn)室中引入ACQUITY Arc系統(tǒng)等現(xiàn)代化的LC平臺(tái)。隨著分析方法越來(lái)越頻繁地在整個(gè)機(jī)構(gòu)中進(jìn)行轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)換到合同研究機(jī)構(gòu)中，我們需要證明分析方法在相同及不同的類似儀器平臺(tái)上能夠獲得一致的結(jié)果。ACQUITY Arc系統(tǒng)不僅可以模擬傳統(tǒng)的HPLC方法，還能應(yīng)用Arc Multi-flow path技術(shù)將HPLC方法升級(jí)為UHPLC方法。通過(guò)將HPLC方法升級(jí)為UHPLC方法并結(jié)合ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器，我們可以將常規(guī)的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)合到分析中，以利于結(jié)果的確認(rèn)。

 

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