細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

細(xì)胞凍存后可保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用；減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性；減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性；減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變；避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。凍存細(xì)胞前，應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定并檢查是否被污染。

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性；緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。需要特別注意的是DMSO 稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量，因此DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。

• 細(xì)胞凍存

1. 細(xì)胞凍存前12-24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞一直處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
2. 待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合時(shí)胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細(xì)胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細(xì)胞則直接離心。
3. 棄上清，加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10^6-1×10^7cells/mL。將細(xì)胞懸液分至凍存管內(nèi)，每管1-1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期等。
4. 按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃過(guò)夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃過(guò)夜，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于最低刻度線；凍存5次后異丙醇需要更換一次，以免影響凍存效果。
5. 細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存，為穩(wěn)妥起見(jiàn)可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，再繼續(xù)凍存。

• 細(xì)胞復(fù)蘇

凍存細(xì)胞十分脆弱，必須輕柔操作。除少數(shù)對(duì)冷凍保護(hù)劑（DMSO或甘油）敏感的細(xì)胞，絕大部分細(xì)胞在解凍之后，可直接接種到完全培養(yǎng)基中，隔天再換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 和死細(xì)胞，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼壁的問(wèn)題，也可因不離心，減少了操作步驟，降低污染的幾率。

1. 將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1-2min內(nèi)完全解凍，盡快通過(guò)最易受損的溫度段（-5-0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，避免引起污染。
2. 用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有完全培養(yǎng)基的離心管內(nèi)制成細(xì)胞懸液。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至少為3×10^5個(gè)活細(xì)胞/mL。
3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
4. 第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO和死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80-90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2-3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。