FDA關(guān)于粗品肝素鈉來源檢測(cè)的方法
開發(fā)一種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè) 原料中反芻動(dòng)物DNA監(jiān)測(cè)肝素鈉粗品質(zhì)量
作者
Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1
1U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. 2U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance, Silver Spring, MD 20993, USA. 3Nebraska Department of Agriculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA.
摘要
開發(fā)一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)豬源肝素鈉粗品中的反芻動(dòng)物源污染。該檢測(cè)法由一套針對(duì)反芻動(dòng)物（牛、綿羊、山羊）和豬的凍干引物、探針及內(nèi)參組成。該方法經(jīng)過兩處分析機(jī)構(gòu)驗(yàn)證：第一個(gè)位于FDA，第二個(gè)位于某州獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室。肝素鈉多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（hMRTA）檢測(cè)方法性能通過了美國(guó)FDA獸藥中心研發(fā)處制定的特異性、靈敏度和專一性嚴(yán)格驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。符合早前建立的飼料中反芻動(dòng)物原料多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法的靈敏度和重復(fù)性要求。hMRTA法檢測(cè)豬源肝素鈉粗品， 98%達(dá)靈敏度，真陽(yáng)性98%、假陰性2%。PCR檢測(cè)法檢測(cè)三個(gè)反芻動(dòng)物物種，可作為判定豬屬來源的初步篩選、復(fù)查確認(rèn)工具。進(jìn)一步保證肝素鈉粗品質(zhì)量，幫助識(shí)別控制肝素鈉生產(chǎn)來源物種。對(duì)粗品肝素鈉的來源控制將保障含肝素鈉藥物和耗材的安全性，保護(hù)公眾健康。
介紹
肝素鈉粗品質(zhì)量監(jiān)控的工業(yè)指南 （草案），旨在幫助藥物活性成分、藥品及醫(yī)療器械生產(chǎn)廠家更好地控制使用的肝素鈉粗品的質(zhì)量，防止OSCS或來自反芻動(dòng)物的污染。要求使用者建立適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法或使用USP方法來鑒別和控制動(dòng)物來源的肝素鈉粗品質(zhì)量。USP專論里已作出規(guī)定，肝素鈉應(yīng)明確標(biāo)明動(dòng)物種類及器官組織的來源。要求采購(gòu)肝素鈉粗品的藥物和醫(yī)療器械廠家要對(duì)每批肝素鈉粗品在生產(chǎn)或準(zhǔn)備生產(chǎn)含肝素鈉藥物或醫(yī)療器械前要鑒別其物種來源。
以下測(cè)定方法使用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝素鈉粗品反芻動(dòng)物污染。用豬源、牛源標(biāo)準(zhǔn)物評(píng)估可靠性。識(shí)別豬源肝素鈉粗品中的反芻動(dòng)物DNA。
操作指南提供了方法的具體細(xì)節(jié)，包括所需試劑、設(shè)備。
材料及方法
建議每批待測(cè)樣品（提取、純化去雜質(zhì)和PCR）都設(shè)立陰性對(duì)照。并同時(shí)給每批BioGX Ruminant and Porcine Beads設(shè)置商業(yè)化基因組DNA（牛、豬、山羊、綿羊）陽(yáng)性對(duì)照。
1、DNA提取
介紹:
從0.5ml干燥肝素鈉粗品中提取DNA的方法描述如下：請(qǐng)?jiān)谔崛〔僮鏖_始前通讀整篇標(biāo)準(zhǔn)操作流程。本方法使用了Invitrogen (Carlsbad, CA)生產(chǎn)的ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit。所有的試劑、槍頭和離心管均為DNase free。 槍頭需有氣溶膠抗性（Aerosol resistant），減少?gòu)腄NA提取到PCR擴(kuò)增過程中樣品之間的交叉污染。因處理的是粉狀物質(zhì)，建議步驟1、2帶上口罩，并與DNA提取、純化和PCR地點(diǎn)隔離。
注意：粗品肝素鈉的PCR檢測(cè)需在其它會(huì)影響DNA完整性的任何前處理（如化學(xué)氧化）前進(jìn)行，以免影響PCR物種檢測(cè)結(jié)果。
1.1. 所需材料：
試劑盒：
ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)
PowerClean® DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50)
BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)
設(shè)備要求:
Micro centrifuge
Heat Block
Nuclease Free Water
Vortex
Invitrogen Magna Rack
2.0 mL Tubes
Smart-Cycler
Smart Cycler centrifuge
Smart Cycler cooling block
SmartCycler 25 µL reaction tubes
1.2. 操作步驟
a. 加入混勻的肝素鈉樣品到2ml離心管的0.5ml標(biāo)記線。
*關(guān)鍵步驟：每次只加一個(gè)樣，前一個(gè)樣品加樣完成前不能打開下一個(gè)離心管。
b. 加入1ml ChargeSwitch Lysis Buffer到樣品中。往離心管加入裂解緩沖液時(shí)，離心管稍微傾斜。
c. 每樣加入100μl ChargeSwitch SDS。渦旋5s混勻。
d. 95℃孵育（水浴或加熱箱）5min。
e. 每樣加入400μl ChargeSwitch Precipitation Buffer（N5）。渦旋5s混勻。
f. 冰浴離心管5min沉淀蛋白。
g. 室溫16100g離心5min。
h. 轉(zhuǎn)移1200μl上清液到一個(gè)新的離心管中。
i. 渦旋裝有ChargeSwitch Magnetic Beads的離心管，充分重懸浸泡在儲(chǔ)存緩沖液中的磁珠。
j. 加入200μl ChargeSwitch Detergent到含上清液的離心管中。
k. 加入40μl充分重懸的ChargeSwitch Magnetic Beads。
l. 上下吹打5次混勻。
m. 室溫孵育1min。
n. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
o. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。
p. 從磁鐵取下離心管。
q. 加入1ml ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
r. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
s. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。
t. 從磁鐵取下離心管。
u. 加入750μl ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
v. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
w. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。
x. 加入750μl ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
y. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
z. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。最后一次
清洗，吸掉所有上清。
aa. 從磁鐵取下離心管，此時(shí)管內(nèi)不應(yīng)有上清液。
bb. 加入75μl ChargeSwitch Elution Buffer（E5）到離心管。
cc. 輕輕上下吹打10次重懸ChargeSwitch Magnetic Beads。
dd. 室溫孵育1min。
ee. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
ff. 離心管留在磁鐵上，小心轉(zhuǎn)移含有DNA的上清到一個(gè)新的滅菌了的2ml離心管中，勿攪動(dòng)
沉淀。吸取上清時(shí)，槍頭不要對(duì)著沉淀。
gg. 棄去用過了的ChargeSwitch Magnetic Beads。
*DNA -20℃冷凍保存或繼續(xù)進(jìn)行DNA純化去雜質(zhì)
2. DNA純化去雜質(zhì)
介紹：
下文描述如何去除以上提取的肝素鈉粗品DNA 中PCR抑制因子（如肝素）。在純化去雜質(zhì)開始前需通讀整篇標(biāo)準(zhǔn)操作流程。本段使用MOBIO（Carlsbad, CA）的PowerClean® DNA Clean-Up Kit。試劑盒提供的所有試劑盒離心管均DNase free。
2.1. 操作步驟
a. 加入75μl nuclease free水到DNA樣品中。
b. 加入750μl PowerClean DNA Solution 1到DNA中。上下顛倒3-5次混勻。
c. 加入20μl PowerClean DNA Solution 2，上下顛倒3-5次混勻。
注意：檢查PowerClean DNA Solution 2，若有沉淀，60℃水浴并輕搖直至沉淀全部溶解。不要?jiǎng)×覔u晃以免產(chǎn)生大量泡沫。可趁熱使用。
d. 加入85μl PowerClean DNA Solution 3，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。
e. 室溫10000g離心1min。
f. 避開沉淀，轉(zhuǎn)移所有上清到一個(gè)干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。
g. 加入70μl PowerClean DNA Solution 4，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。
h. 室溫10000g離心1min。
i. 避開沉淀，把上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。
j. 搖勻PowerClean DNA Solution 5。加入800μl PowerClean DNA Isolation 5到上清中，渦旋5s
混勻。
k. 加載600μl上清液到Spin Filter中，室溫10000g離心1min。
l. 棄去濾液，把剩余的600μl上清都加到Spin Filter上，室溫10000g離心1min。
m. 棄去濾液。加入500μl PowerClean DNA Solution 6到Spin Filer，室溫10000g離心30s。
n. 棄去濾膜。
o. 室溫13000g離心2min。
p. 小心把Spin Filter轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2ml Collection tube（試劑盒提供）中。避免沾到任何PowerClean DNA Isolation 6。
q. 加入75μl PowerClean DNA Solution 7到白色濾膜中心。
r. 室溫10000g離心30s。
s. 棄去Spin Filter。-20℃冷凍保存直至PCR擴(kuò)增。
3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
設(shè)計(jì)該操作流程/步驟是為使用Cepheid的SmartCycler分析豬源肝素樣品中反芻動(dòng)物DNA的存在。在其他操作平臺(tái)上使用該步驟需要適當(dāng)?shù)募右哉{(diào)整以驗(yàn)證這部分是否符合（相對(duì)應(yīng)平臺(tái)的）標(biāo)準(zhǔn)程序。
3.1. 準(zhǔn)備實(shí)時(shí)檢測(cè)
a. 從冰箱中取出裝有樣品制備珠管的可重復(fù)用密封袋。從密封區(qū)域頂部的缺口
撕開袋子。
b. 從袋中取出所需數(shù)量的管子，并輕輕打開每一根管子。
c. 向每管中加入25 µL無核酸水（無核酸污染的水），用槍頭混合后蓋上管蓋。
d. 使用微量離心機(jī)將所有管子快速離心5s。
e. 珠子空白對(duì)照（珠子+無DNA的水）必須與每一批待測(cè)樣品同時(shí)檢測(cè)。
3.2. 步驟
a. 分裝25 µL先前準(zhǔn)備好的預(yù)混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反應(yīng)管。
b. 向每一根對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管中加入1 µL樣品。
c. 蓋上管蓋，在SmartCycler離心機(jī)中離心5s。
d. 將PCR反應(yīng)管放入SmartCycler區(qū)塊的每一孔中并蓋上各個(gè)蓋子。
e. 準(zhǔn)備運(yùn)行程序：
f. 點(diǎn)擊"Create Run"圖標(biāo)。染料設(shè)置選擇FCTC。
g. 選擇操作規(guī)程（見3.3部分）。
h. 選擇適當(dāng)數(shù)量的位點(diǎn)（即在運(yùn)行的PCR管的數(shù)量）
i. 給每一個(gè)位點(diǎn)標(biāo)注一個(gè)與每管組分相對(duì)應(yīng)的樣品ID。
j. 點(diǎn)擊"Start Run"。
注：陽(yáng)性結(jié)果需要有一個(gè)循環(huán)閾值（Ct值）。
3.3 PCR反應(yīng)條件
這一操作規(guī)程必須在PCR運(yùn)行開始前加以設(shè)定。使用唯一的名稱保存參數(shù)。
PCR程序：
第一階段：95.0°C 120s（光學(xué)元件關(guān)閉）
第二階段：45個(gè)循環(huán)
95.0°C 10s（光學(xué)元件關(guān)閉）
56.0°C 60s（光學(xué)元件開啟）
注：分析時(shí)，Ct值應(yīng)設(shè)定成缺省值30
4. 結(jié)果分析
染料設(shè)定為FCTC，用于熒光檢測(cè)。反芻動(dòng)物DNA的陽(yáng)性結(jié)果的判定是一個(gè)樣品在FAM通道45個(gè)反應(yīng)循環(huán)之前出現(xiàn)Ct值。豬的材料的陽(yáng)性結(jié)果是在TxR通道出現(xiàn)陽(yáng)性的Ct值。內(nèi)部擴(kuò)增控制（IAC）在Cy5通道中報(bào)告，有助于降低假陰性報(bào)告。許多不同類型肝素樣品含有抑制劑。本試驗(yàn)包括一個(gè)IAC，以確保PCR的條件是合適的，這樣，最大限度地減少由熱啟動(dòng)酶的抑制造成的假陰性結(jié)果報(bào)告。具體地講，IAC可以反映樣品中存在PCR抑制因子時(shí)報(bào)道的陰性結(jié)果。引物與探針能結(jié)合反應(yīng)混合物中合成的序列。
當(dāng)樣品中沒有PCR抑制因子，而靶目標(biāo)沒有擴(kuò)增時(shí)，IAC應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生Ct值為32-37之間的信號(hào)。如果目標(biāo)樣品是高濃度，IAC可能會(huì)也可能不會(huì)報(bào)告由于競(jìng)爭(zhēng)而出現(xiàn)的擴(kuò)增。這是正常的。
如果IAC在Ct值37處仍未出現(xiàn)，或者在目的擴(kuò)增中沒有報(bào)告（其Ct值），樣品可能含有阻止目的檢測(cè)的PCR抑制劑。如果觀察到這一結(jié)果，建議將分裝的新的肝素粗品重提并額外純化后使用。
對(duì)于反芻動(dòng)物樣品的陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)用PCR對(duì)同一DNA樣品額外檢測(cè)兩次，即全部三次檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的，則確認(rèn)該樣品為陽(yáng)性。
作者
Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1
1U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. 2U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance, Silver Spring, MD 20993, USA. 3Nebraska Department of Agriculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA.
摘要
開發(fā)一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)豬源肝素鈉粗品中的反芻動(dòng)物源污染。該檢測(cè)法由一套針對(duì)反芻動(dòng)物（牛、綿羊、山羊）和豬的凍干引物、探針及內(nèi)參組成。該方法經(jīng)過兩處分析機(jī)構(gòu)驗(yàn)證：第一個(gè)位于FDA，第二個(gè)位于某州獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室。肝素鈉多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（hMRTA）檢測(cè)方法性能通過了美國(guó)FDA獸藥中心研發(fā)處制定的特異性、靈敏度和專一性嚴(yán)格驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。符合早前建立的飼料中反芻動(dòng)物原料多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法的靈敏度和重復(fù)性要求。hMRTA法檢測(cè)豬源肝素鈉粗品， 98%達(dá)靈敏度，真陽(yáng)性98%、假陰性2%。PCR檢測(cè)法檢測(cè)三個(gè)反芻動(dòng)物物種，可作為判定豬屬來源的初步篩選、復(fù)查確認(rèn)工具。進(jìn)一步保證肝素鈉粗品質(zhì)量，幫助識(shí)別控制肝素鈉生產(chǎn)來源物種。對(duì)粗品肝素鈉的來源控制將保障含肝素鈉藥物和耗材的安全性，保護(hù)公眾健康。
介紹
肝素鈉粗品質(zhì)量監(jiān)控的工業(yè)指南 （草案），旨在幫助藥物活性成分、藥品及醫(yī)療器械生產(chǎn)廠家更好地控制使用的肝素鈉粗品的質(zhì)量，防止OSCS或來自反芻動(dòng)物的污染。要求使用者建立適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法或使用USP方法來鑒別和控制動(dòng)物來源的肝素鈉粗品質(zhì)量。USP專論里已作出規(guī)定，肝素鈉應(yīng)明確標(biāo)明動(dòng)物種類及器官組織的來源。要求采購(gòu)肝素鈉粗品的藥物和醫(yī)療器械廠家要對(duì)每批肝素鈉粗品在生產(chǎn)或準(zhǔn)備生產(chǎn)含肝素鈉藥物或醫(yī)療器械前要鑒別其物種來源。
以下測(cè)定方法使用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝素鈉粗品反芻動(dòng)物污染。用豬源、牛源標(biāo)準(zhǔn)物評(píng)估可靠性。識(shí)別豬源肝素鈉粗品中的反芻動(dòng)物DNA。
操作指南提供了方法的具體細(xì)節(jié)，包括所需試劑、設(shè)備。
材料及方法
建議每批待測(cè)樣品（提取、純化去雜質(zhì)和PCR）都設(shè)立陰性對(duì)照。并同時(shí)給每批BioGX Ruminant and Porcine Beads設(shè)置商業(yè)化基因組DNA（牛、豬、山羊、綿羊）陽(yáng)性對(duì)照。
1、DNA提取
介紹:
從0.5ml干燥肝素鈉粗品中提取DNA的方法描述如下：請(qǐng)?jiān)谔崛〔僮鏖_始前通讀整篇標(biāo)準(zhǔn)操作流程。本方法使用了Invitrogen (Carlsbad, CA)生產(chǎn)的ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit。所有的試劑、槍頭和離心管均為DNase free。 槍頭需有氣溶膠抗性（Aerosol resistant），減少?gòu)腄NA提取到PCR擴(kuò)增過程中樣品之間的交叉污染。因處理的是粉狀物質(zhì)，建議步驟1、2帶上口罩，并與DNA提取、純化和PCR地點(diǎn)隔離。
注意：粗品肝素鈉的PCR檢測(cè)需在其它會(huì)影響DNA完整性的任何前處理（如化學(xué)氧化）前進(jìn)行，以免影響PCR物種檢測(cè)結(jié)果。
1.1. 所需材料：
試劑盒：
ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)
PowerClean® DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50)
BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)
設(shè)備要求:
Micro centrifuge
Heat Block
Nuclease Free Water
Vortex
Invitrogen Magna Rack
2.0 mL Tubes
Smart-Cycler
Smart Cycler centrifuge
Smart Cycler cooling block
SmartCycler 25 µL reaction tubes
1.2. 操作步驟
a. 加入混勻的肝素鈉樣品到2ml離心管的0.5ml標(biāo)記線。
*關(guān)鍵步驟：每次只加一個(gè)樣，前一個(gè)樣品加樣完成前不能打開下一個(gè)離心管。
b. 加入1ml ChargeSwitch Lysis Buffer到樣品中。往離心管加入裂解緩沖液時(shí)，離心管稍微傾斜。
c. 每樣加入100μl ChargeSwitch SDS。渦旋5s混勻。
d. 95℃孵育（水浴或加熱箱）5min。
e. 每樣加入400μl ChargeSwitch Precipitation Buffer（N5）。渦旋5s混勻。
f. 冰浴離心管5min沉淀蛋白。
g. 室溫16100g離心5min。
h. 轉(zhuǎn)移1200μl上清液到一個(gè)新的離心管中。
i. 渦旋裝有ChargeSwitch Magnetic Beads的離心管，充分重懸浸泡在儲(chǔ)存緩沖液中的磁珠。
j. 加入200μl ChargeSwitch Detergent到含上清液的離心管中。
k. 加入40μl充分重懸的ChargeSwitch Magnetic Beads。
l. 上下吹打5次混勻。
m. 室溫孵育1min。
n. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
o. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。
p. 從磁鐵取下離心管。
q. 加入1ml ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
r. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
s. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。
t. 從磁鐵取下離心管。
u. 加入750μl ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
v. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
w. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。
x. 加入750μl ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
y. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
z. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對(duì)著沉淀物。最后一次
清洗，吸掉所有上清。
aa. 從磁鐵取下離心管，此時(shí)管內(nèi)不應(yīng)有上清液。
bb. 加入75μl ChargeSwitch Elution Buffer（E5）到離心管。
cc. 輕輕上下吹打10次重懸ChargeSwitch Magnetic Beads。
dd. 室溫孵育1min。
ee. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀，上清變清澈（約
1min）。
ff. 離心管留在磁鐵上，小心轉(zhuǎn)移含有DNA的上清到一個(gè)新的滅菌了的2ml離心管中，勿攪動(dòng)
沉淀。吸取上清時(shí)，槍頭不要對(duì)著沉淀。
gg. 棄去用過了的ChargeSwitch Magnetic Beads。
*DNA -20℃冷凍保存或繼續(xù)進(jìn)行DNA純化去雜質(zhì)
2. DNA純化去雜質(zhì)
介紹：
下文描述如何去除以上提取的肝素鈉粗品DNA 中PCR抑制因子（如肝素）。在純化去雜質(zhì)開始前需通讀整篇標(biāo)準(zhǔn)操作流程。本段使用MOBIO（Carlsbad, CA）的PowerClean® DNA Clean-Up Kit。試劑盒提供的所有試劑盒離心管均DNase free。
2.1. 操作步驟
a. 加入75μl nuclease free水到DNA樣品中。
b. 加入750μl PowerClean DNA Solution 1到DNA中。上下顛倒3-5次混勻。
c. 加入20μl PowerClean DNA Solution 2，上下顛倒3-5次混勻。
注意：檢查PowerClean DNA Solution 2，若有沉淀，60℃水浴并輕搖直至沉淀全部溶解。不要?jiǎng)×覔u晃以免產(chǎn)生大量泡沫。可趁熱使用。
d. 加入85μl PowerClean DNA Solution 3，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。
e. 室溫10000g離心1min。
f. 避開沉淀，轉(zhuǎn)移所有上清到一個(gè)干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。
g. 加入70μl PowerClean DNA Solution 4，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。
h. 室溫10000g離心1min。
i. 避開沉淀，把上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。
j. 搖勻PowerClean DNA Solution 5。加入800μl PowerClean DNA Isolation 5到上清中，渦旋5s
混勻。
k. 加載600μl上清液到Spin Filter中，室溫10000g離心1min。
l. 棄去濾液，把剩余的600μl上清都加到Spin Filter上，室溫10000g離心1min。
m. 棄去濾液。加入500μl PowerClean DNA Solution 6到Spin Filer，室溫10000g離心30s。
n. 棄去濾膜。
o. 室溫13000g離心2min。
p. 小心把Spin Filter轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2ml Collection tube（試劑盒提供）中。避免沾到任何PowerClean DNA Isolation 6。
q. 加入75μl PowerClean DNA Solution 7到白色濾膜中心。
r. 室溫10000g離心30s。
s. 棄去Spin Filter。-20℃冷凍保存直至PCR擴(kuò)增。
3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
設(shè)計(jì)該操作流程/步驟是為使用Cepheid的SmartCycler分析豬源肝素樣品中反芻動(dòng)物DNA的存在。在其他操作平臺(tái)上使用該步驟需要適當(dāng)?shù)募右哉{(diào)整以驗(yàn)證這部分是否符合（相對(duì)應(yīng)平臺(tái)的）標(biāo)準(zhǔn)程序。
3.1. 準(zhǔn)備實(shí)時(shí)檢測(cè)
a. 從冰箱中取出裝有樣品制備珠管的可重復(fù)用密封袋。從密封區(qū)域頂部的缺口
撕開袋子。
b. 從袋中取出所需數(shù)量的管子，并輕輕打開每一根管子。
c. 向每管中加入25 µL無核酸水（無核酸污染的水），用槍頭混合后蓋上管蓋。
d. 使用微量離心機(jī)將所有管子快速離心5s。
e. 珠子空白對(duì)照（珠子+無DNA的水）必須與每一批待測(cè)樣品同時(shí)檢測(cè)。
3.2. 步驟
a. 分裝25 µL先前準(zhǔn)備好的預(yù)混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反應(yīng)管。
b. 向每一根對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管中加入1 µL樣品。
c. 蓋上管蓋，在SmartCycler離心機(jī)中離心5s。
d. 將PCR反應(yīng)管放入SmartCycler區(qū)塊的每一孔中并蓋上各個(gè)蓋子。
e. 準(zhǔn)備運(yùn)行程序：
f. 點(diǎn)擊"Create Run"圖標(biāo)。染料設(shè)置選擇FCTC。
g. 選擇操作規(guī)程（見3.3部分）。
h. 選擇適當(dāng)數(shù)量的位點(diǎn)（即在運(yùn)行的PCR管的數(shù)量）
i. 給每一個(gè)位點(diǎn)標(biāo)注一個(gè)與每管組分相對(duì)應(yīng)的樣品ID。
j. 點(diǎn)擊"Start Run"。
注：陽(yáng)性結(jié)果需要有一個(gè)循環(huán)閾值（Ct值）。
3.3 PCR反應(yīng)條件
這一操作規(guī)程必須在PCR運(yùn)行開始前加以設(shè)定。使用唯一的名稱保存參數(shù)。
PCR程序：
第一階段：95.0°C 120s（光學(xué)元件關(guān)閉）
第二階段：45個(gè)循環(huán)
95.0°C 10s（光學(xué)元件關(guān)閉）
56.0°C 60s（光學(xué)元件開啟）
注：分析時(shí)，Ct值應(yīng)設(shè)定成缺省值30
4. 結(jié)果分析
染料設(shè)定為FCTC，用于熒光檢測(cè)。反芻動(dòng)物DNA的陽(yáng)性結(jié)果的判定是一個(gè)樣品在FAM通道45個(gè)反應(yīng)循環(huán)之前出現(xiàn)Ct值。豬的材料的陽(yáng)性結(jié)果是在TxR通道出現(xiàn)陽(yáng)性的Ct值。內(nèi)部擴(kuò)增控制（IAC）在Cy5通道中報(bào)告，有助于降低假陰性報(bào)告。許多不同類型肝素樣品含有抑制劑。本試驗(yàn)包括一個(gè)IAC，以確保PCR的條件是合適的，這樣，最大限度地減少由熱啟動(dòng)酶的抑制造成的假陰性結(jié)果報(bào)告。具體地講，IAC可以反映樣品中存在PCR抑制因子時(shí)報(bào)道的陰性結(jié)果。引物與探針能結(jié)合反應(yīng)混合物中合成的序列。
當(dāng)樣品中沒有PCR抑制因子，而靶目標(biāo)沒有擴(kuò)增時(shí)，IAC應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生Ct值為32-37之間的信號(hào)。如果目標(biāo)樣品是高濃度，IAC可能會(huì)也可能不會(huì)報(bào)告由于競(jìng)爭(zhēng)而出現(xiàn)的擴(kuò)增。這是正常的。
如果IAC在Ct值37處仍未出現(xiàn)，或者在目的擴(kuò)增中沒有報(bào)告（其Ct值），樣品可能含有阻止目的檢測(cè)的PCR抑制劑。如果觀察到這一結(jié)果，建議將分裝的新的肝素粗品重提并額外純化后使用。
對(duì)于反芻動(dòng)物樣品的陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)用PCR對(duì)同一DNA樣品額外檢測(cè)兩次，即全部三次檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的，則確認(rèn)該樣品為陽(yáng)性。
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