菌落計數(shù)_創(chuàng)新技術(四)：多菌種混雜情況的檢測
在菌落計數(shù)中，常常會碰到這樣一種情況，即培養(yǎng)皿中生長著多種不同種類的菌落：有真菌、細菌、霉菌、放線菌等等。不同種類的菌落，往往顏色不同、生長形態(tài)不同。尤其是霉菌和放線菌，其表面往往呈碎顆粒狀，碎顆粒的密度不一樣，中間密度高從而顏色深、邊上密度低從而顏色淺；另外其邊緣往往呈毛刺狀或云霧狀，面積則比一般菌落大許多。圖1顯示了三個包含霉菌和其它菌混雜的培養(yǎng)皿。
圖1 多菌種混雜生長的培養(yǎng)皿
圖2 傳統(tǒng)圖像分割技術對多菌種混雜情況的處理結果
圖1 多菌種混雜生長的培養(yǎng)皿
這種多菌種混雜、尤其是存在霉菌和放線菌的情況，給自動化菌落計數(shù)帶來困難。這是由于目前的自動化菌落計數(shù)是建立在圖像分割技術基礎上，而圖像分割主要依據(jù)目標物與背景之間的差異性來進行的，比如兩者的灰度差異、顏色差異、或邊緣輪廓的突變性等等。
圖2顯示了采用傳統(tǒng)圖像分割技術，對包含霉菌的多菌種混雜的培養(yǎng)皿的分割效果。其中，圖2-a是培養(yǎng)皿原圖、圖2-b是采用傳統(tǒng)圖像分割技術的分割結果、圖2-c是對分割后的顆粒進行顏色填充以方便觀察。不難看到：（1）由于霉菌表面呈碎顆粒狀，導致圖像分割將其分成一顆顆碎小顆粒。（2）霉菌表面的顏色變化，其邊緣呈乳白色云霧狀，轉換成灰度后與其它白色菌落接近；而中間成墨綠色，轉換成灰度后與背景的灰度相接近。這就導致傳統(tǒng)的灰度分割技術必然把邊緣部分當作菌落一類、而把中心部分當作背景一類來處理。（3）霉菌邊緣的云霧狀或模糊性，導致沒有明顯的邊緣梯度變化，從而無法采用邊緣梯度分割技術。
圖2顯示了采用傳統(tǒng)圖像分割技術，對包含霉菌的多菌種混雜的培養(yǎng)皿的分割效果。其中，圖2-a是培養(yǎng)皿原圖、圖2-b是采用傳統(tǒng)圖像分割技術的分割結果、圖2-c是對分割后的顆粒進行顏色填充以方便觀察。不難看到：（1）由于霉菌表面呈碎顆粒狀，導致圖像分割將其分成一顆顆碎小顆粒。（2）霉菌表面的顏色變化，其邊緣呈乳白色云霧狀，轉換成灰度后與其它白色菌落接近；而中間成墨綠色，轉換成灰度后與背景的灰度相接近。這就導致傳統(tǒng)的灰度分割技術必然把邊緣部分當作菌落一類、而把中心部分當作背景一類來處理。（3）霉菌邊緣的云霧狀或模糊性，導致沒有明顯的邊緣梯度變化，從而無法采用邊緣梯度分割技術。
圖2 傳統(tǒng)圖像分割技術對多菌種混雜情況的處理結果
基于水平集活動輪廓模型的圖像分割技術，是目前國際上較為前沿的圖像處理技術。該技術將水平集和活動輪廓模型結合起來，在極小化能量泛函的過程中，使活動輪廓不斷逼近目標而實現(xiàn)對目標的分割。這一特點尤其適合對霉菌的檢測，事實上，杭州迅數(shù)科技公司歷經多年研究，已成功應用水平集活動輪廓模型解決霉菌放線菌等的檢測，并取得理想效果（詳見本公司網站文獻《菌落計數(shù)_創(chuàng)新技術（1~3）》）。
但當霉菌放線菌與其它菌種混合在一起時，問題就變得更加復雜。這時，采用水平集活動輪廓模型往往對一種菌落有效、而對另一種菌落效果不好。在調整模型參數(shù)或約束條件后，對另一種菌落有效了、而對這種菌落的效果又不好了。事實上，上述培養(yǎng)皿所表現(xiàn)出來的，是一個多菌種、多目標、多特征的復雜問題。采用單一的水平集活動輪廓模型，已經無法取得理想效果。針對多目標、多特征的分割問題，目前國際上研究較多的主要有以下兩種方法：（1）多相CV模型、（2）多層水平集框架模型。
1、多相CV模型
由Chan和Vese提出的一種多相水平集分割算法，即多相CV模型[1]。該算法在確定目標種類數(shù)之后，采用m個水平集函數(shù)相互約束地分割，并且可以用m個水平集函數(shù)表示2m個不重疊區(qū)域，從而避免在區(qū)域內部存在真空或者區(qū)域之間存在重疊現(xiàn)象。
多相CV模型的能量泛函為：
但當霉菌放線菌與其它菌種混合在一起時，問題就變得更加復雜。這時，采用水平集活動輪廓模型往往對一種菌落有效、而對另一種菌落效果不好。在調整模型參數(shù)或約束條件后，對另一種菌落有效了、而對這種菌落的效果又不好了。事實上，上述培養(yǎng)皿所表現(xiàn)出來的，是一個多菌種、多目標、多特征的復雜問題。采用單一的水平集活動輪廓模型，已經無法取得理想效果。針對多目標、多特征的分割問題，目前國際上研究較多的主要有以下兩種方法：（1）多相CV模型、（2）多層水平集框架模型。
1、多相CV模型
由Chan和Vese提出的一種多相水平集分割算法，即多相CV模型[1]。該算法在確定目標種類數(shù)之后，采用m個水平集函數(shù)相互約束地分割，并且可以用m個水平集函數(shù)表示2m個不重疊區(qū)域，從而避免在區(qū)域內部存在真空或者區(qū)域之間存在重疊現(xiàn)象。
多相CV模型的能量泛函為：
其中u0是原圖像數(shù)據(jù)，cI是第I個區(qū)域的平均灰度值，xI是第I個區(qū)域的水平集表示，Фi為第i個水平集函數(shù)。以分割四相圖像為例，引入兩個水平集函數(shù)Ф1和Ф2，與此對應須設置兩個初始輪廓，設圖像u0被分為四個相互不重疊區(qū)域：
則能量泛函演變?yōu)椋?/DIV>
圖3兩相水平集示意圖
其中Ф=(φ1,φ2)，c=(c11,c10,c01,c00)中的分量分別代表圖像u0在Ω11，Ω12，Ω21和Ω22區(qū)域內的平均灰度，如圖3所示。
圖3兩相水平集示意圖
該模型中的兩個輪廓短線同時演化，對應水平集函數(shù)也分別進行迭代運算，通過求解上式能量泛函對應的Euler-Lagrange方程可以得到梯度下降流公式如下：
其中灰度均值c11，c10，c01和c00可分別在每次迭代中采用如下方式進行更新：
2、多層水平集框架[2]
與多相CV模型采用多個水平集函數(shù)不同，多層水平集框架是建立在一種圖層的概念上的，并且只用一個基于CV模型的水平集函數(shù)，以一種層級演化的方式來進行多目標分割，屬于串行多相分割算法。
定義原始圖層為
與多相CV模型采用多個水平集函數(shù)不同，多層水平集框架是建立在一種圖層的概念上的，并且只用一個基于CV模型的水平集函數(shù)，以一種層級演化的方式來進行多目標分割，屬于串行多相分割算法。
定義原始圖層為
其中，
代表第l類目標的第i個區(qū)域。lm表示第l類目標的區(qū)域數(shù)目，并集
表示第l類目標的集合，
為背景區(qū)。
首先利用單水平集分割出原始圖層L0，提取第一類目標區(qū)域，然后用除第一類目標區(qū)以外的區(qū)域灰度平均值掩蓋該第一類目標區(qū)，產生一個新的背景區(qū)域類
，圖層狀態(tài)變?yōu)椋?/DIV>
圖4 原始圖像層L0向新圖像層L1的轉換
圖5基于多層水平集框架模型的分割效果
代表第l類目標的第i個區(qū)域。lm表示第l類目標的區(qū)域數(shù)目，并集表示第l類目標的集合，為背景區(qū)。首先利用單水平集分割出原始圖層L0，提取第一類目標區(qū)域，然后用除第一類目標區(qū)以外的區(qū)域灰度平均值掩蓋該第一類目標區(qū)，產生一個新的背景區(qū)域類
，圖層狀態(tài)變?yōu)椋?/DIV>
原始圖層L0到新圖層L1的轉換過程如圖4所示。原始圖層L0包含兩類目標
和
，當?shù)谝活惸繕藚^(qū)域
被分割出并用第二類目標區(qū)域與背景區(qū)域的灰度平均值替換時，形成圖層L1，這樣L1中只剩下第二類目標區(qū)域，剩下區(qū)域視為背景。當待分割圖像有多類目標區(qū)域時，可以利用這一思想逐個分出某一類目標區(qū)域，直到沒有目標為止，數(shù)學歸納如下：
和，當?shù)谝活惸繕藚^(qū)域被分割出并用第二類目標區(qū)域與背景區(qū)域的灰度平均值替換時，形成圖層L1，這樣L1中只剩下第二類目標區(qū)域，剩下區(qū)域視為背景。當待分割圖像有多類目標區(qū)域時，可以利用這一思想逐個分出某一類目標區(qū)域，直到沒有目標為止，數(shù)學歸納如下：圖4 原始圖像層L0向新圖像層L1的轉換
最終得到不含任何目標的圖層Ln，即背景層Lbackground：
多層水平集框架仍依賴于CV模型，與傳統(tǒng)CV模型不同的是，水平集函數(shù)一次只作用于一個圖層，并對產生的新圖層進行迭代演化，所以引入水平集函數(shù)，第l層(l=0,1,2,…,n-1)上的能量函數(shù)為：
與CV模型中參數(shù)相同，Cl表示Ll層上的演化曲線。引入時間變量t≥0，可得Ll上的水平集演化方程：
3、試驗
以上介紹的多相CV模型，是一種并行模型。其可在不加約束條件的情況下，避免水平集函數(shù)作用區(qū)域的重疊覆蓋以及漏覆蓋問題。但多個水平集最終可能收斂到一個區(qū)域，另外該模型假定了圖像中區(qū)域的個數(shù)。而實際菌落圖像往往很復雜，難以人為劃定區(qū)域，因此這種方法實際使用時會比較麻煩。多層水平集框架，屬于水平集串行分割方法。其每次分割得到的輪廓曲線位于前一次分割得到的輪廓曲線內部，可以保證各水平集收斂目標不同，且具有從屬關系，使用相對簡單。本試驗主要采用多層水平集框架模型。
圖5顯示了對多菌種、多特征菌落采用多層水平集框架模型的檢測效果。其中圖5-a是原圖、圖5-b是采用多層水平集框架模型的分割結果、圖5-c對分割輪廓內部進行顏色填充以便觀察。為解決部分菌落相互粘連的問題，試驗中增加了分水嶺粘連分割。
由圖5不難看到，由于水平集活動輪廓模型分割技術是在極小化能量泛函的過程中，使活動輪廓不斷逼近目標而實現(xiàn)對目標的分割，所以不存在對霉菌表面微小顆粒的過分割現(xiàn)象。此外，能量函數(shù)建立在輪廓內外的灰度方差基礎上，因此活動輪廓在收縮時，不會受各種菌落顏色不同的影響而導致誤分割。除極個別地方尚不完善外，絕大多數(shù)菌落都得到了準確的分割。
以上介紹的多相CV模型，是一種并行模型。其可在不加約束條件的情況下，避免水平集函數(shù)作用區(qū)域的重疊覆蓋以及漏覆蓋問題。但多個水平集最終可能收斂到一個區(qū)域，另外該模型假定了圖像中區(qū)域的個數(shù)。而實際菌落圖像往往很復雜，難以人為劃定區(qū)域，因此這種方法實際使用時會比較麻煩。多層水平集框架，屬于水平集串行分割方法。其每次分割得到的輪廓曲線位于前一次分割得到的輪廓曲線內部，可以保證各水平集收斂目標不同，且具有從屬關系，使用相對簡單。本試驗主要采用多層水平集框架模型。
圖5顯示了對多菌種、多特征菌落采用多層水平集框架模型的檢測效果。其中圖5-a是原圖、圖5-b是采用多層水平集框架模型的分割結果、圖5-c對分割輪廓內部進行顏色填充以便觀察。為解決部分菌落相互粘連的問題，試驗中增加了分水嶺粘連分割。
由圖5不難看到，由于水平集活動輪廓模型分割技術是在極小化能量泛函的過程中，使活動輪廓不斷逼近目標而實現(xiàn)對目標的分割，所以不存在對霉菌表面微小顆粒的過分割現(xiàn)象。此外，能量函數(shù)建立在輪廓內外的灰度方差基礎上，因此活動輪廓在收縮時，不會受各種菌落顏色不同的影響而導致誤分割。除極個別地方尚不完善外，絕大多數(shù)菌落都得到了準確的分割。
圖5基于多層水平集框架模型的分割效果
4、展望
基于水平集活動輪廓模型的圖像分割方法，具有抗噪性強、數(shù)值求解穩(wěn)定性好、分割邊界光滑連續(xù)、可以處理拓撲結構復雜的情況等優(yōu)點，成為目前國際上最前沿的圖像分割技術之一。多相CV模型和多層水平集框架模型都是基于水平集為基礎，在解決多目標、多特征的分割問題上具有較好效果。為多菌種混雜情況的菌落檢測提供了一種可行的方法。
但多相CV模型和多層水平集框架模型的每次迭代計算都需要初始化，導致計算量較大，分割耗時。隨著問題復雜性的增加，其計算復雜性也顯著升高。除此之外，這兩種方法初始輪廓的選取還存在偶然性，預選區(qū)域的大小及形狀均會影響分割的結果，須要進一步研究。
5、參考文獻
[1] Zheng Gang, Li Yuanlu, Wang Huinan. A new multi-phase level set framework for 3D medical image segmentation based on TPBG [C]. 27th Annual International Conference of IEEE EMBC05, Shanghai, 2005.
[2] 王曉峰.水平集方法及其在圖像分割中的應用研究[J].中國科學技術大學，2011(02).
杭州迅數(shù)科技有限公司 研發(fā)部
基于水平集活動輪廓模型的圖像分割方法，具有抗噪性強、數(shù)值求解穩(wěn)定性好、分割邊界光滑連續(xù)、可以處理拓撲結構復雜的情況等優(yōu)點，成為目前國際上最前沿的圖像分割技術之一。多相CV模型和多層水平集框架模型都是基于水平集為基礎，在解決多目標、多特征的分割問題上具有較好效果。為多菌種混雜情況的菌落檢測提供了一種可行的方法。
但多相CV模型和多層水平集框架模型的每次迭代計算都需要初始化，導致計算量較大，分割耗時。隨著問題復雜性的增加，其計算復雜性也顯著升高。除此之外，這兩種方法初始輪廓的選取還存在偶然性，預選區(qū)域的大小及形狀均會影響分割的結果，須要進一步研究。
5、參考文獻
[1] Zheng Gang, Li Yuanlu, Wang Huinan. A new multi-phase level set framework for 3D medical image segmentation based on TPBG [C]. 27th Annual International Conference of IEEE EMBC05, Shanghai, 2005.
[2] 王曉峰.水平集方法及其在圖像分割中的應用研究[J].中國科學技術大學，2011(02).
杭州迅數(shù)科技有限公司 研發(fā)部
