利用安捷倫SampliQ SCX 固相萃取柱和液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)豬肉中的β2-激動(dòng)劑

應(yīng)用報(bào)告/食品安全

作者: Chenhao Zhai 安捷倫科技有限公司
中國上海外高橋保稅區(qū)，英倫路412 號(hào) 上海，200131 中國

Jianzhong Li and Yue Song 安捷倫科技有限公司
福州路318 號(hào), 高騰大廈11 樓 上海200001 中國

摘要
本應(yīng)用報(bào)告開發(fā)并驗(yàn)證了一種同時(shí)檢測(cè)四種β2-激動(dòng)劑殘留物的方法，包括特布他林、 沙丁胺醇、克侖特羅和福莫特羅。分析物經(jīng)過液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)純化后， 由正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的液相色譜耦合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)進(jìn)行定量。

該方法為檢測(cè)豬肉中四種β2-激動(dòng)劑提供了亞ng/g 水平的檢測(cè)限（LOD），以及0.25 至5 ng/g 的動(dòng)態(tài)校準(zhǔn)范圍。總回收率為78%至101%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%至7.2%。

前言
β2-激動(dòng)劑是廣泛應(yīng)用于豬肉生產(chǎn)中的一種非法生長(zhǎng)促進(jìn)劑。最近發(fā)生的中毒事件都是因?yàn)樨i肉中含有高水平的β-激動(dòng)劑（克侖特羅）。本應(yīng)用報(bào)告采用了安捷倫公司新推出的固相萃�。⊿PE）產(chǎn)品來提取和濃縮豬肉中的β-激動(dòng)劑，并采用LC-MS/MS 進(jìn)行分析。表1 給出了四種β-激動(dòng)劑化合物的名稱和結(jié)構(gòu)。

表1. 本研究中采用的β2-激動(dòng)劑化合物

實(shí)驗(yàn)
試劑及藥品
所有試劑都是質(zhì)譜純級(jí)、高效液相純級(jí)或分析純級(jí)。

乙腈和水由Scharlau 公司提供。乙酸乙酯、異丙醇由Fisher 公司提供。標(biāo)準(zhǔn)物均采購自國家藥品生物制品檢定所（NICPBP）。 豬肉則由本地市場(chǎng)采購。 以甲醇配制單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/mL），并在4 °C 下冷藏。

以甲醇-水(10:90) 配制合并工作溶液（10 μg/mL），并在4 °C 下冷藏。添加溶液應(yīng)每周配制, 以適當(dāng)稀釋合并工作溶液來制備。

設(shè)備與材料
安捷倫1200 高效液相色譜系統(tǒng)
安捷倫6460 三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)
安捷倫SamliQ SCX 聚合物柱，50×3 mL 管，60 mg（部件號(hào)：5982-3236）
安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱，50 × 2.1 mm, 1.8 μm (部件號(hào): 959741-906)
安捷倫真空歧管處理盒(部件號(hào): 5982-9120)

樣品制備
液-液提取
于15mL 帶蓋聚丙烯管中稱取2 g 豬肉（精確至±0.01 g）。加入 8 mL 0.2M 的乙酸鈉（pH 值5.2）溶液，并渦旋以混合均勻。然后加入100 μL β-葡萄糖醛酸酶（1000 U/mL）并渦旋混合2 分鐘。樣品在37 °C 下水解16 小時(shí)。

水解產(chǎn)物經(jīng)震動(dòng)處理15 分鐘后，在離心機(jī)中用4000rpm 的速度離心分離10 分鐘。取4 mL 上層清液至另一離心管中，加入5 mL
0.1M 高氯酸溶液并調(diào)節(jié)pH 值至1 ± 0.3，再在離心機(jī)中以 4000 rpm 的速度離心分離10 分鐘。將上層清液移至另一試管中，用10M 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH 值至11。

于樣品試管中分別添加10 mL 飽和氯化鈉溶液和異丙醇-乙酸乙酯（60:40）混合液，并震動(dòng)處理5 分鐘。以4000 rpm 離心分離5 分鐘后, 將有機(jī)層仔細(xì)轉(zhuǎn)移至另一離心管中。將異丙醇-乙酸乙酯混合液的添加、震動(dòng)處理、離心分離和轉(zhuǎn)移有機(jī)液層的過程重復(fù)兩次，并將所有上清液合并。

樣品于40 °C 以氮?dú)獯蹈桑�并將殘留物�?fù)溶于5 mL 0.2M 的乙酸鈉（pH 值5.2）溶液中。該樣品將用于固相萃取純化。

固相萃取
固相萃取過程（SPE）如圖1 中所示。先用3 mL 甲醇活化安捷倫SampliQ SCX 柱，然后用3 mL 水平衡。取5 毫升樣品溶液載入到柱中，并以重力通過色譜柱（約1 mL/min）。用2 mL 水和2 mL

2%甲酸水溶液沖洗SPE 小柱，丟棄所有洗脫液。真空抽干SPE 小柱。最后以5 mL 5%氨甲醇溶液洗脫，流速約為1 mL/min。洗脫液于40 °C 氮?dú)獯蹈�，殘留物�?fù)溶于1 mL 0.1%甲酸的水/乙腈 （90:10）溶液。樣品經(jīng)渦旋混合和超聲波處理以完全溶解后轉(zhuǎn)移 至1.5 mL 離心管中，并在3000 rpm 條件下處理5 分鐘。最后將樣品轉(zhuǎn)移至2 mL 的色譜小瓶中等待分析。

圖1. 豬肉的清理和濃縮-固相萃取過程

儀器條件
高效液相色譜條件
色譜柱: 安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱，
50 × 2.1 mm, 1.8 μm (部件號(hào): 959741-906)
流速: 0.4 mL/min
柱溫: 40 °C
進(jìn)樣體積: 5 μL
流動(dòng)相: 水（0.1%甲酸溶液+2mM乙酸銨，A），
乙腈（0.1%甲酸, B）

梯度淋洗:

質(zhì)譜條件
在正極模式下對(duì)4 種化合物進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。離子源條件如圖2 所示，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)通道如表2 中所示。

圖2. 四種化合物的質(zhì)譜源參數(shù)

表2. 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的質(zhì)量監(jiān)測(cè)

結(jié)果與討論
線性與檢測(cè)限
標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（0.25，0.5，1.0，2.0 和5.0 ng/g）是以添加適量混合工作溶液于空白基質(zhì)來配制的。空白基體是通過將豬肉進(jìn)行水解、液液萃取和固相萃取來制備的。校準(zhǔn)曲線的結(jié)果如表3 中所示。檢測(cè)限(LOD)定義為每個(gè)化合物給出信噪比(S/N)大于3:1 的時(shí)濃度。各化合物的檢測(cè)限也列于表3 中。

表3. β2-激動(dòng)劑的線性和檢測(cè)限

回收率和重現(xiàn)性
在豬肉中分別添加標(biāo)樣濃度為0.5, 1.0, 2.0 ng/g, 計(jì)算回收率和重現(xiàn)性。每個(gè)濃度重復(fù)分析6 次。回收率和重現(xiàn)性數(shù)據(jù)列于表4 中。 添加豬肉萃取物（1.0 ng/g）的色譜圖如圖3 中所示。

表4. 采用安捷倫SampliQ SCX 進(jìn)行固相萃取豬肉中β2-激動(dòng)劑的回收率和重現(xiàn)性；(部件號(hào): 5982-3236)， 平均回收率90%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差4.4%

圖3. 1.0 ng/g 添加豬肉樣品萃取物的色譜圖

結(jié)論
本研究表明，安捷倫SampliQ SCX 可以作為在復(fù)雜基體中（如豬肉）進(jìn)行多種β2-激動(dòng)劑的純化和濃縮的有效方法。用標(biāo)準(zhǔn)添加基質(zhì)所測(cè)定的回收率和重現(xiàn)性, 符合豬肉中β2-激動(dòng)劑殘留物檢測(cè)的中國國家標(biāo)準(zhǔn)。雜質(zhì)以及基質(zhì)效應(yīng)是不會(huì)干擾任何目標(biāo)化合物的定量，最低定量限明顯低于最高殘留限量[1,2]。

參考文獻(xiàn)
1. GB/T 21313-2007“動(dòng)物源性食品中β2-激動(dòng)劑的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析”
2. SN/T 1924-2007“進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中的克侖特羅、雷托巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留物的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定”

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