高靈敏度化學(xué)發(fā)光技術(shù)應(yīng)用心得

瀏覽次數(shù)：10229　發(fā)布日期：2010-1-4　來源：Bio-Rad

黃磊

一．概述

化學(xué)發(fā)光 (ChemiLuminescence ，簡稱為 CL) 分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類，它主要是依據(jù)化學(xué)檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法�；瘜W(xué)發(fā)光與其它發(fā)光分析的本質(zhì)區(qū)別是體系產(chǎn)生發(fā)光 ( 光輻射 ) 所吸收的能量來源不同。體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，必須具有一個產(chǎn)生可檢信號的光輻射反應(yīng)和一個可一次提供導(dǎo)致發(fā)光現(xiàn)象足夠能量的單獨(dú)反應(yīng)步驟的化學(xué)反應(yīng)。

化學(xué)發(fā)光Western 雜交檢測，是同位素檢測的一種高度靈敏的替代方法。酶標(biāo)記抗體取代了放射性標(biāo)記抗體，當(dāng)它作用于底物時，可產(chǎn)生光信號。多數(shù)特異抗原檢測方法以辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)二級抗體耦聯(lián)物為基礎(chǔ)。信號可通過感光膠片或?qū)Ｓ玫某上裨O(shè)備來采集。化學(xué)發(fā)光底物用于免疫印跡技術(shù)已有十幾年的歷史，目前大部分實(shí)驗(yàn)室做轉(zhuǎn)印時都會采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行檢測。隨著冷CCD化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在越來越多的實(shí)驗(yàn)室都開始采用冷CCD的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，膠片成像雖然比自然發(fā)光法靈敏度更高，但也有很多缺點(diǎn)：耗時，需要暗房，顯影劑和膠片，膠片較貴且為需持續(xù)購買的消耗品。同時由于膠片的線性范圍較窄，因此用膠片上的條帶（特別是表達(dá)量較低的條帶）進(jìn)行定量幾乎不可能。冷CCD技術(shù)與X膠片相比具有瞬時影像處理、高靈敏度和高分辨率、動力范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此能對條帶進(jìn)行精確定量。當(dāng)然這項(xiàng)技術(shù)要求底物能產(chǎn)生高強(qiáng)度長持續(xù)時間的信號，以保證信號能被冷CCD的凝膠成像系統(tǒng)捕獲。在這方面多家公司都提供了相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物或試劑盒，特別是Bio-Rad公司提供的Western-C化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，底物可產(chǎn)生高強(qiáng)度的持續(xù)光信號24小時，因此用戶可以進(jìn)行多次曝光，最低可檢測至10^-19mol，配合Bio-Rad屢獲大獎的化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS或VersaDoc系統(tǒng)能得到得到高質(zhì)量的印記信號。

我們實(shí)驗(yàn)室從05年開始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，目前已經(jīng)形成一套較為成熟的技術(shù)路線，取得大批的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本文將就Western Blotting的關(guān)鍵步驟及使用ChemiDocXRS的一些心得體會與大家一起分享。

二．轉(zhuǎn)印過程

轉(zhuǎn)印蛋白的方法有多種，最常用的是電泳轉(zhuǎn)印方法，該技術(shù)具有快速、有效、并保持蛋白在凝膠中高分辨率的特性。電泳轉(zhuǎn)印技術(shù)是指在凝膠中分離的蛋白質(zhì)向印跡膜載體轉(zhuǎn)印的過程。由于該技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速、高效的將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，并可以保持蛋白在凝膠中高的分辨率，而被廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)中。

常用的電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)有槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，前者是將凝膠和印跡膜浸入轉(zhuǎn)印緩沖液槽，然后加電壓進(jìn)行轉(zhuǎn)印；后者是將凝膠和印跡膜放置于濾紙間形成三明治結(jié)構(gòu)，而后在電極平板間進(jìn)行轉(zhuǎn)印。兩種系統(tǒng)間的比較見表1.1

表1.1 電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的比較

	槽轉(zhuǎn)印	半干轉(zhuǎn)印
靈活性	可靈活選擇電壓設(shè)置、轉(zhuǎn)印時間和冷卻方法；可靈活更換電極位置（Trans-Blot和Trans-Blot Plus 印跡槽）	快速、高強(qiáng)度轉(zhuǎn)印，使用少量電轉(zhuǎn)印緩沖液，無冷卻系統(tǒng)
定量和定性結(jié)果	小分子量范圍可以提供高效而定量的蛋白轉(zhuǎn)印	小分子量蛋白與印跡膜很少結(jié)合，發(fā)生轉(zhuǎn)印并穿透印跡膜
分子量范圍	寬分子量范圍	對于分子量大于120kD蛋白的轉(zhuǎn)印效率不穩(wěn)定，小分子量蛋白會轉(zhuǎn)印穿透印跡膜
轉(zhuǎn)印時間	可以在不耗盡緩沖液時延長轉(zhuǎn)印時間到24h；高強(qiáng)度轉(zhuǎn)印只需15-60min	快速轉(zhuǎn)��；不適用于延時轉(zhuǎn)印
溫度控制	冷卻芯和循環(huán)冷卻水，可以在很低的溫度進(jìn)行轉(zhuǎn)�。�4-10℃），例如原酶轉(zhuǎn)印	無冷卻系統(tǒng)
緩沖能力	緩沖液10-12L（Trans-Blot槽）或450ml（Mini Trans-Blot槽）緩沖液不限制轉(zhuǎn)印時間	少量，每次實(shí)驗(yàn)只需要250ml，節(jié)約試劑成本和縮短轉(zhuǎn)印時間

電泳轉(zhuǎn)印過程中，凝膠和印跡膜平行放置于兩極間，見圖1.2。根據(jù)歐姆定律（Ohm’s）：

V=I*R，R為兩極間物質(zhì)的電阻值，（即轉(zhuǎn)印緩沖液、凝膠、印跡膜、濾紙的電阻值），當(dāng)電極兩端加有電壓時，就會在上述物質(zhì)間產(chǎn)生電流，蛋白樣品便發(fā)生轉(zhuǎn)印。

由于兩極間的電場強(qiáng)度（V/cm）是蛋白轉(zhuǎn)移的驅(qū)動力，因此兩極間的電壓和距離稱為凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印的關(guān)鍵參數(shù)。同樣其他參數(shù)包括蛋白的大小、形狀、所帶電荷多少，電轉(zhuǎn)印緩沖液的pH值、黏度、離子強(qiáng)度、以及凝膠密度也影響著蛋白的電轉(zhuǎn)印效率。

在轉(zhuǎn)印過程中將產(chǎn)生大量熱量，因此對電場強(qiáng)度要有一定的限制。轉(zhuǎn)印中產(chǎn)生的焦耳熱（Joule）與電源參數(shù)P成正比，P=I*V=I²R。電泳轉(zhuǎn)印緩沖液的溫度隨著焦耳熱的增加而升高，此時其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會使轉(zhuǎn)印過程和電場強(qiáng)度發(fā)生變化，從而影響電轉(zhuǎn)印緩沖液的緩沖能力。同時，系統(tǒng)過熱還會引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉(zhuǎn)印效率。

本室主要以濕轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)印，因此本文就濕轉(zhuǎn)為例，對化學(xué)發(fā)光和ChemiDoc XRS的應(yīng)用進(jìn)行敘述。
一、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）：
（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜廴灸�。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。
（2）在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過的PVDF膜。
（3）打開夾子將黑的一面放入轉(zhuǎn)膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。
     注意:1整個過程在轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行在鋪每一層時要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。
          2撬玻璃板剝膠時動作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊
（4）將夾子合好，放到轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。接通電電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準(zhǔn)備好的冰盒來降溫。將整個電泳槽放入一個大的容器中（大的塑料泡沫盒子最好），在這個容器中盛滿冰。
（5） 250毫安恒流轉(zhuǎn)膜2小時。
（6）2小時后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。
（7）用5%脫脂奶粉室溫封閉。
封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。
脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進(jìn)行封閉，且足以覆蓋住膜。
二、孵育一抗
     一抗用BSA溶解，根據(jù)抗體說明書上的要求稀釋抗體（大部分稀釋度為1：1000），4℃過夜。也可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長或縮短時間。
（有些一抗室溫孵育一小時也可得到滿意的結(jié)果）
三、孵育二抗
室溫孵育1小時。一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:2000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。
注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時間一定要夠。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
四、曝光
      本實(shí)驗(yàn)室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒（已針對CCD成像做了優(yōu)化），可獲得更好的效果。
（1）洗膜，2至3次，每次5分鐘
（2）在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。
作用：a 保證PVDF膜能在一個相對干凈的平臺上曝光，避免污染。
        b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當(dāng)半透明的PVDF膜在白測光下照Marker時，會更清晰、明顯。
（3）將膜放入照膠儀，調(diào)整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標(biāo)一個印記。
（4）選擇EPI WHITE 光，點(diǎn)擊“White Epi IIIumination”點(diǎn)擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調(diào)至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉(zhuǎn)至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。
（5）將發(fā)光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發(fā)光液能蓋住膜即可，關(guān)閉WHITE EPI光（注意膜的位置從照Marker開始，不要改變）點(diǎn)擊“Chem Hi Sensitivity”，點(diǎn)擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時間，張數(shù)，選擇指定文件夾，保存。
選擇比較滿意的圖片，按如上所說轉(zhuǎn)換至jpeg格式。
例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調(diào)至10s一張，一般10張之內(nèi)就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當(dāng)延長時間。
        對于內(nèi)參來說，在曝第一張之前，讓發(fā)光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時會得到理想的效果。
（6）marker與目的條帶的比對：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點(diǎn)住剛剛用圓珠筆畫的印記，手不要松開，此時還用“圖片和傳真查看器”打開jpeg格式的目的條帶的圖片，手點(diǎn)的地方就是剛才marker的位置。

白測光下獲取的marker圖像

化學(xué)發(fā)光下目的蛋白條帶    蛋白上樣量：120μg 分離膠濃度：12%

白測光下獲取的marker圖像

化學(xué)發(fā)光下目的蛋白條帶蛋白上樣量：80μg 分離膠濃度：12%

白測光下獲取的marker圖像

化學(xué)發(fā)光下目的蛋白條帶蛋白上樣量：50μg 分離膠濃度：15%

結(jié)論：采用Bio-Rad的冷CCD化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測，比傳統(tǒng)的暗室曝光方法更為簡便，也大大縮短了實(shí)驗(yàn)時間。但在成像時需要注意選擇合適的化學(xué)發(fā)光試劑，以適合CCD的成像檢測。且大部分的化學(xué)發(fā)光試劑均對應(yīng)暗室曝光的方式，因此在進(jìn)行檢測需要進(jìn)行調(diào)整，如對發(fā)光液不能進(jìn)行稀釋，而必須要使用原液。同時如果條帶的表達(dá)比較弱的情況下，如使用常用發(fā)光液可能需要更長的成像時間，當(dāng)然更好的方法是選擇能快速產(chǎn)生強(qiáng)烈信號的化學(xué)發(fā)光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒。