介紹: 
核酸定量是分子生物學工作流程中的一個重要步驟，特別是對于qPCR 和下一代測序 (NGS) 等高級應用而言。在 NGS 中，最終目標是生成高度復雜的文庫，并以最大程度的深度和均一性進行測序，因此準確定量尤為重要。準確測定核酸濃度的兩個關鍵步驟是：

1) 在最大酶效率對 DNA 輸入量敏感的文庫制備前和 2) 在文庫制備后標準化樣品以在測序前匯集。此外，對越來越少的樣本輸入（例如，用于 RNA-seq 實驗）的需求以及從許多常見樣本類型（如 FFPE 和ccfDNA）中分離核酸的挑戰(zhàn)使得濃度估計變得困難。

雖然存在多種定量方法，但基于熒光染料的系統(tǒng)因其靈敏度、目標選擇性、成本和易用性而被推薦用于高級下游應用。使用QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)，熒光染料原液被稀釋形成工作溶液，添加到含有少量體積的純化 DNA 樣品的微孔板中，并使用熒光計測量熒光。靈敏且準確的 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)可用于定量單管以及96 孔和 384 孔板中的 dsDNA。 

要保證小體積重復移液過程中的準確性會是件困難的事，而且過程中勞動密集，會出現失誤和代價高昂的返工情況。因此，大多數需要更高通量的實驗室選擇用自動化機器人液體處理平臺來進行定量分析。MANTIS® 是一種新型臺式液體處理器，可滿足高通量試劑分配的許多要求，而其成本僅為大型系統(tǒng)的一小半。對于核酸定量，MANTIS®可準確分配少量體積的 QuantiFluor® 染料工作溶液，以獲得可重現的定量結果。在本應用說明中，我們展示了 MANTIS® 液體處理器的兼容性，它可以快速準確地自動化進行 96 孔和 384 孔板格式的 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)的試劑處理。

所需材料

• MANTIS® 儀器 (Formulatrix)

• 大容量芯片 (Formulatrix Cat.# MCHS6)

• QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng) (Cat.# E2670)

• 無核酸酶水 (Cat.# P1195)

• 黑色平底 96 孔板(Corning Cat.# 3915) 或384 孔板(Corning Cat.# 3573)

• 15ml 或 50ml 錐形管

• 可測量熒光的多孔檢測儀 (e.g., GloMax Discover System [Cat.# GM3000])

實驗方案: 

試劑制備: 

1. 制備 1X TE 緩沖液: 用無核酸酶水將 20X TE 緩沖液稀釋 20 倍。

2. 制備 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液。

a. 96 孔格式：在 1X TE 緩沖液中按 1:400 稀釋 QuantiFluor® dsDNA 染料。有關詳細使用說明，請參閱QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)技術手冊 #TM346。

b. 384 孔格式：根據您所需的分析要求進行染料稀釋。（請參閱使用 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)進行高通量、低體積 DNA 定量應用說明，了解如何選擇合適的染料稀釋度 。 ）這里我們在1X TE 緩沖液中使用 1:200 稀釋的 QuantiFluor® dsDNA 染料來定量 0.05–50ng DNA。

3. 制備標準曲線: 使用已知濃度的 dsDNA 標準品和 1X TE 緩沖液進行連續(xù)稀釋，該緩沖液在任何未知樣品的濃度范圍上下延伸。對于空白樣品，使用 1X TE 緩沖液。

儀器設置: 

4. 打開 MANTIS® 桌面應用程序并選擇“文件”>“新建分配列表”。從列表中選擇您的測定板。

5. 軟件將提示用戶將試劑添加到分配列表中。在“試劑名稱”字段中輸入“QuantiFluor dsDNA”，完成后選擇“確 定”。

6. 將 QuantiFluor dsDNA 分配到芯片位置 #1

7. 將 QuantiFluor® dsDNA 工作溶液置于芯片位置 #1 的試劑架中。將試管從芯片放入試劑中。

8. 充注芯片并設置新的液體分配，具體做法為選擇所需的孔并輸入所選孔的目標體積

a. 96 孔格式：將 200 µl 工作溶液分配到每個孔中。

b. 384 孔格式：將 36 µl 工作溶液分配到每個孔中。

9. 將微孔板添加到 MANTIS®deck 并按下 。

分析測定：

10. 手動將標準品、空白和未知樣品移液到多孔板各自的孔中。

c. 96-孔格式: 添加 1–20 µl 標準品、空白和未知樣品。

d. 384-孔格式: 添加 4µl 標準品、空白和未知樣品。

11. 使用搖板器或通過移液器移液每個孔中的液體將微孔板徹底混合。未能充分混合將導致孔之間的讀數變化。還要避免引入氣泡，這會干擾熒光。

12. 在室溫下培養(yǎng)測定物5 分鐘。

13. 檢測熒光 (504nmEx/531nmEm)。如果使用 GloMax® Systems 檢測儀器，請選擇預加載的方案：“QuantiFluor dsDNA 系統(tǒng)”。

14. 計算 dsDNA 濃度如下：從每個標準和樣品熒光中去除空白樣品（1X TE 緩沖液）的熒光。使用來自DNA 標準的校正數據生成熒光與 DNA 濃度的標準曲線。通過線性回歸或冪回歸確定標準曲線中任何未知樣品的 DNA 濃度。

標準化:

15. 來自 GloMax® 檢測儀器的濃度值可以直接導入 MANTIS® 軟件，以計算標準化所需的體積（參見圖 1 和圖2）。

圖 1. 使用 MANTIS® 液體處理器分配 96 孔板（圖 A）和 384 孔板（圖 B）中的 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液，對K562 人類基因組 DNA 標準品（Cat.# E4931）進行定量。在 GloMax® Discover System 上測量熒光，并從冪回歸標準曲線內插入未知樣品。

圖 2. 用于模擬 mRNA 轉錄本平均大小的 2,200bp PCR 產物的定量。 Mantis 液體處理器用于分配 96 孔板形式（圖 A）和384 孔板形式（圖 B）的 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)。在 GloMax® Discover System 上測量熒光，并從冪回歸標準曲線內插入未知樣品。

總結
MANTIS® 液體處理器為研究人員提供了一個靈活的工作站，可在幾分鐘內建立各種實驗方案。精確執(zhí)行這些方案以提高實驗室效率和實驗重現性。本應用說明展示了液體處理軟件的易用性，它可快速無縫地過渡到自動化平臺。使用 MANTIS® 液體處理器為 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)添加試劑可在多層微孔板中實現可重現的定量，幾乎無需儀器編程。