介紹: 
核心實(shí)驗(yàn)室在提供與廣泛的客戶、樣本類型和測(cè)序方法相關(guān)的各種下一代測(cè)序(NGS) 服務(wù)時(shí)，必須平衡好其 NGS 工作流程的效率與他們生成的數(shù)據(jù)的質(zhì)量。隨著測(cè)序成本的下降，與文庫(kù)制備相關(guān)的費(fèi)用開(kāi)始成為整個(gè) NGS 工作流程成本的大頭。為了解決測(cè)序中的這一主要費(fèi)用問(wèn)題，許多機(jī)構(gòu)跟隨了反應(yīng)小型化的趨勢(shì)，有效地將反應(yīng)體積減少到制造商推薦體積的 10%。

本應(yīng)用說(shuō)明重點(diǎn)介紹了即使在低細(xì)胞輸入的情況下也能通過(guò)精確的正排量微流控試劑分配生成高質(zhì)量 NGS 文庫(kù)的工作流程。四分之一體積的 Illumina Nextera XT 文庫(kù)制備的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)展示了反應(yīng)小型化在單細(xì)胞測(cè)序背景下的適用性和有效性。

材料: 

• Eppendorf twin.tec 384 板 (PN 0030129342)

• Illumina Nextera XT DNA 文庫(kù)制備試劑盒 (PN FC-131-1096)

• Illumina Nextera XT 索引試劑盒 V2 (FC-131-2001)

• 熱循環(huán)儀

• FORMULATRIX® MANTIS® 液體處理器 (PN MANTV3.2)

• Alpaqua 384 柱式磁板 (PN A001222)

• ThermoFisher Qubit 4 熒光計(jì) (PN Q33226)

• Agilent 2100 Bioanalyzer (PN G2939BA)

方法: 
四分之一體積的 Illumina Nextera XT 文庫(kù)制備
在該試點(diǎn)項(xiàng)目中使用了 8 個(gè)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞 cDNA 樣本（3 種細(xì)胞類型；1 ng 的input DNA ），然后通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)方案評(píng)估以四分之一體積產(chǎn)生的文庫(kù)的質(zhì)量：

A. Tagment cDNA – 總反應(yīng)體積為6.35 µL 

1. 在 384 孔微孔板的孔中加入 1.25 µL input DNA。

2. 將 TD 緩沖液吸入 200 µL 移液器吸頭*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 2.5μL 的 TD 緩沖液分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

3.混合。

4. 將 ATM 吸到 200 µL 移液器吸頭*中，然后置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 1.3μL 的 ATM 分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

5. 混合。

6.熱循環(huán):

    i. 55℃下保持5 分鐘

    ii. 之后一直保持10℃

7. 將 NT 緩沖液吸入 200 µL 移液器吸頭*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 1.3µL 的 NT 緩沖液分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

8.混合。

9.室溫培養(yǎng) 5 分鐘。

B. 文庫(kù)擴(kuò)增– 12.65 µL 總反應(yīng)體積

1. 將 NPM 吸入 200 µL 移液器吸頭*，并置于 MANTIS 的 LV 芯片上。將 3.8 µL 分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

2. 手動(dòng)移取 1.25 µL 兩種index primer置于樣品中，以便每個(gè)樣品獲得獨(dú)特的index primer組合。

3. 混合。

4. 熱循環(huán):

   i. 72℃下3分鐘

   ii. 95℃ 下30秒

   iii. 以下做12 次循環(huán)

         a. 95℃下 10 秒

         b. 55℃ 下 30 秒

         c. 72℃ 下 30 秒

   iv. 72℃下5 分鐘

   v. 一直保持10℃

C. 文庫(kù)清理

1.將 AMpure XP 微珠吸入 200 µL 移液器吸頭*，然后置于 MANTIS 的 HV 芯片上。將10 µL 分配到MANTIS微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

2.混合。

3.室溫培養(yǎng)5分鐘

4.將微孔板放在磁上，等待 2 分鐘

5.手動(dòng)去除所有上清液（在第 11 步之前不要從磁上取下微孔板）

6.在 MANTIS 上使用持續(xù)流功能選項(xiàng)，將 50 µL 80% EtOH 添加到微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

7.培養(yǎng)30秒。

8.手動(dòng)去除所有上清液，同時(shí)將微孔板置于磁上。

9.重復(fù)步驟 6-8。

10. 風(fēng)干 15 分鐘。

11. 從磁上取下微孔板。

12. 將 RSB 吸到 200 µL 移液器吸頭*中，然后放在 MANTIS 上的 HV 芯片上。

13. 分配15 µL至MANTIS微孔板上含有樣品的每個(gè)孔中。

14. 混合。

15. 在室溫下培養(yǎng) 2 分鐘。

16. 將微孔板放在磁上。

17. 培養(yǎng) 2 分鐘。

18. 手動(dòng)將 12.5 µL 從微珠轉(zhuǎn)移到新微孔板上。

D. 吸入量 = 每個(gè)樣品的分配量 x 樣品數(shù)量 + 10% 安全系數(shù)。 當(dāng)吸入量大于 200 µL 時(shí)，請(qǐng)使用 1000 µL 移液器吸頭。

結(jié)果: 
通過(guò) Agilent BioAnalyzer 的追蹤評(píng)估每個(gè)樣品的 Nextera 文庫(kù)質(zhì)量。

圖 1. 從 8 個(gè)獨(dú)特的 1ng 鼠神經(jīng)元細(xì)胞 cDNA 樣本制備的 8 個(gè)下一代測(cè)序文庫(kù)的 Bio nalyzer 追蹤

總結(jié): 
根據(jù)BioAnalyzer 數(shù)據(jù)追蹤，通過(guò)四分之一體積反應(yīng)小型化制備的文庫(kù)組成是可以接受的，并且與按照全體積實(shí)驗(yàn)方案制備的文庫(kù)組成相當(dāng)。

以四分之一體積制備文庫(kù)可顯著節(jié)省每次反應(yīng)試劑盒成本的 75%。 FORMULATRIX® 的MANTIS® 液體處理器通過(guò)以低至 100 nL 的體積進(jìn)行精確的微流控試劑分配，促進(jìn)反應(yīng)小型化，并且無(wú)耗材、使用簡(jiǎn)單且可靠。