使用Antha軟件平臺(tái)增強(qiáng)MANTIS®液體處理器的功能
為了最大限度地提高使用細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的各種生物制劑的質(zhì)量和產(chǎn)量，研究人員需要一直優(yōu)化生長(zhǎng)條件。這涉及操縱多種生長(zhǎng)培養(yǎng)基和過(guò)程變量（因子）以確定它們?nèi)绾斡绊?/span>質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況 (QTPP)，并且生長(zhǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)上都是使用單次單因子 (OFAT) 方法。

盡管OFAT被廣泛使用，但只有在所研究的變量因子不相互影響的情況下，OFAT 才真正有效。但在實(shí)際工作中，不相互影響的情況很少見。為了克服OFAT的局限性，作為一種更復(fù)雜方法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)法(DoE)走上臺(tái)前，研究者用它來(lái)并行研究多個(gè)因子并揭示這些因子是如何相互關(guān)聯(lián)的。然而，盡管 DoE 有很多地方優(yōu)于 OFAT ，但由于操作經(jīng)驗(yàn)的缺乏和液體處理的復(fù)雜性以及速度和通量這些會(huì)立刻變化的多因子限制，它在生物技術(shù)行業(yè)的使用受到限制。

為了克服這些挑戰(zhàn)，我們將Synthace的Antha軟件平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)操作計(jì)劃和數(shù)據(jù)管理功能與FORMULATRIX的高速自動(dòng)化MANTIS®液體處理器相結(jié)合。DoE不再是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，研究人員現(xiàn)在可以有效地開展 DoE 活動(dòng)。使用eGFP的生產(chǎn)作為一個(gè)生物產(chǎn)品的指標(biāo)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，一個(gè)有著12變量因子的 DoE 涉及1298次獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行和近10000 個(gè)液體處理步驟，可以在3周內(nèi)僅通過(guò)3次 DoE 迭代優(yōu)化生長(zhǎng)條件，使eGFP得到 5 倍 增產(chǎn)。

DoE 使同時(shí)研究多個(gè)實(shí)驗(yàn)變量成為可能
科學(xué)實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)上依賴于OFAT方法，即除了正在研究的因子外，實(shí)驗(yàn)裝置中的所有內(nèi)容都保持不變。這種方法的問(wèn)題在于，按順序處理不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)會(huì)阻礙研究人員看到它們之間的相互作用，這種相互作用通常發(fā)生在許多生物系統(tǒng)中。這可能導(dǎo)致為下游研究選擇次優(yōu)條件，并限制對(duì)所研究系統(tǒng)的科學(xué)洞察力。

DoE克服了OFAT 方法的局限性，能讓研究人員同時(shí)研究許多不同的實(shí)驗(yàn)因子。這不僅增強(qiáng)了對(duì)所研究因子 如何在多個(gè)維度上相互作用并影響正在研究過(guò)程的理解，而且還增加了找到穩(wěn)健的最佳條件的可能性（見圖 1 ）。

盡管與 OFAT 相比，DoE 提供了卓越的洞察力，但它的實(shí)驗(yàn)執(zhí)行通常不容易通過(guò)自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)。例如，一個(gè)典型的全因子實(shí)驗(yàn)按 2n 指數(shù)擴(kuò)展（其中 n 是要研究的因子的數(shù)量）。在擴(kuò)展方面其他更高效的設(shè)計(jì)都可能面臨類似的挑戰(zhàn)，這意味著即使可以使用自動(dòng)化液體處理器，DoE 執(zhí)行的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃也會(huì)迅速變得笨拙。

與 OFAT 實(shí)驗(yàn)不同，DoE 從根本上說(shuō)是一種優(yōu)化方法，它提供了對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù) (CPP) 及其對(duì)生物生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 的影響的理解。DoE實(shí)驗(yàn)的每個(gè)部分都能讓實(shí)驗(yàn)者在他們對(duì)所研究系統(tǒng)的科學(xué)理解之上進(jìn)行構(gòu)建。

通過(guò)使研究人員能夠通過(guò)使用 DoE 來(lái)利用更多的科學(xué)見解，旨在簡(jiǎn)化 DoE 實(shí)施的解決方案正在科學(xué)界得到廣泛采用，因?yàn)樗鼈優(yōu)閷?shí)驗(yàn)研究提供了更大的價(jià)值。

圖 1. 單次單因子法 (OFAT) 和試驗(yàn)設(shè)計(jì)法(DoE) 的比較。 (A) OFAT 方法假設(shè)因子不相互作用并且最優(yōu)條件是正交的，從而得到次優(yōu)工藝條件。 (B) DoE 的統(tǒng)計(jì)框架考慮因子和正交性之間的相互作用，并更有效地探索實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)空間，增強(qiáng)對(duì)過(guò)程的理解并增加找到穩(wěn)健最佳條件的可能性。

將 MANTIS® 與 Antha 相結(jié)合可簡(jiǎn)化 DoE

在最近的一個(gè)案例研究中，Synthace Ltd 的研究人員將他們的 Antha 軟件平臺(tái)與來(lái)自Formulatrix 的高速自動(dòng)化 MANTIS 液體處理器相結(jié)合，以執(zhí)行復(fù)雜的多因子 (DoE) 培養(yǎng)基優(yōu)化。本研究之所以選擇使用 MANTIS 是因?yàn)槠潴w積小——能夠輕松裝入生物安全柜——以及其大容量移液體積范圍以及與篩選大量不同培養(yǎng)基組合所需的高容量 96 深孔板的先天兼容性。

使用 eGFP 的生產(chǎn)作為一個(gè)生物產(chǎn)品的指標(biāo)，在 3 次 DoE 迭代中選擇了 12 個(gè)因子進(jìn)行研究：

• 胰蛋白胨 (2–12 g/L)

• 酵母提取物 (5–25 g/L)

• 葡萄糖 (0, 5 g/L)

• 甘油 (0, 0.65% v/v) 

• MgSO4 (0.2, 0.3 g/L)

• 氯化鈉 (0, 5 g/L)

• 鼠李糖 (0.5, 3.0 mM)

• 生長(zhǎng)溫度 (25, 37°C) 

• 搖動(dòng)速度 (80, 1000 rpm) 

• 接種量 (15, 30 μL) 

• 復(fù)制起點(diǎn) (pBR322, pUC) 

• 收獲時(shí)間 (8, 24 hours)

研究人員通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)軟件生成 DoE 設(shè)計(jì)文件開始研究，這些文件是精心構(gòu)建的運(yùn)行和條件列表，其中包含中心點(diǎn)、復(fù)制和對(duì)照以滿足統(tǒng)計(jì)要求 。接下來(lái)，將設(shè)計(jì)文件上傳到 Antha，其中還包含 DoE 自動(dòng)化工作流程。該工作流程模擬了所有單獨(dú)的液體處理步驟，因此降低了此類復(fù)雜實(shí)驗(yàn)的物理操作風(fēng)險(xiǎn)，如圖2所示。在此之后，Antha 對(duì) MANTIS 進(jìn)行了編程，以執(zhí)行 DoE 活動(dòng)的第一次迭代的液體處理步驟。

圖 2. Antha 中液體處理步驟的可視化模擬。在初始篩選 DoE 中，使用了 825 個(gè)液體處理步驟來(lái)設(shè)置 96 個(gè)深孔板之一。左側(cè)的“板”是 MANTIS® 試劑架的抽象表示。在右側(cè)，可以在模擬中的任何點(diǎn)選擇任何孔，以檢查工作流程中添加的液體。

總的來(lái)說(shuō)，此處描述的 DoE 實(shí)驗(yàn)需要在 3 次 DoE 迭代中執(zhí)行 1,298 次獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行：11 個(gè)因子用于初始篩選，4 個(gè)因子具有精細(xì)水平，3 個(gè)因子用于驗(yàn)證優(yōu)化的介質(zhì)和工藝條件。這分別相當(dāng)于設(shè)置 13 個(gè)單獨(dú)的 96 深孔板所需的 6660、1414 和 1717 個(gè)液體處理步驟。

Antha 控制了所有規(guī)劃步驟，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)置示意圖引導(dǎo)用戶選擇所需的庫(kù)存濃度、體積和實(shí)驗(yàn)室器具（參見圖2）。同時(shí)，MANTIS 在及時(shí)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，僅使用11個(gè)芯片即可分配研究中涉及的全部液體試劑。統(tǒng)計(jì)軟件與兩個(gè)平臺(tái)的集成提供了一個(gè)迭代設(shè)計(jì)/測(cè)試/分析循環(huán)，以極大地簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析和模型改進(jìn)，如圖3所示。

圖 3. 迭代、自動(dòng)化 DoE 的通用過(guò)程。 (A) Antha 軟件平臺(tái)將來(lái)自統(tǒng)計(jì)軟件 (JMP®) 的輸入轉(zhuǎn)換為 MANTIS® 的液體處理說(shuō)明文件。 Antha 然后匯集來(lái)自酶標(biāo)儀的終點(diǎn)時(shí)間過(guò)程數(shù)據(jù)，并執(zhí)行一套預(yù)處理步驟來(lái)清理數(shù)據(jù)集以進(jìn)行即時(shí)分析，包括重復(fù)分組、空白校正、相對(duì)熒光單位 (RFU) 和光學(xué)映射 密度 (OD) 數(shù)據(jù)和基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，例如平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和 CV。 (B) 更詳細(xì)地說(shuō)，包括 0 、2、 、6、8 和 24 小時(shí)的過(guò)程讀數(shù)、空白、對(duì)照和細(xì)胞密度讀數(shù)的 100 多個(gè)單獨(dú)的讀板機(jī)數(shù)據(jù)文件與 Antha 的執(zhí)行運(yùn)行信息相匹配，以生成 以流線型和自動(dòng)化的方式校正細(xì)胞密度和相對(duì)熒光信號(hào)。

在短短 3 周內(nèi)提高產(chǎn)量
使用 Antha 軟件平臺(tái)和 MANTIS 液體處理器聯(lián)合執(zhí)行復(fù)雜的多因子培養(yǎng)基優(yōu)化，研究人員證明，在 3 周內(nèi)僅執(zhí)行 3 次 DoE 迭代，eGFP 產(chǎn)量就比對(duì)照增加了 5 倍（見圖 4）。這一成功的基礎(chǔ)是兩個(gè)平臺(tái)的易使用、具有成本效益和集成設(shè)置，可以快速確定影響生物指標(biāo) eGFP 生產(chǎn)的因子。

圖4. 優(yōu)化 12 種生長(zhǎng)培養(yǎng)基因子，使 eGFP 產(chǎn)量在 3 周內(nèi)平均增加 5 倍。定制篩選設(shè)計(jì)用于生成第一次迭代(DoE 1) 中 11 個(gè)因子對(duì) eGFP 生產(chǎn)的貢獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)概況。從 DoE 1 中確定了促成最高 eGFP 產(chǎn)量的關(guān)鍵因子，然后在第二次迭代 (DoE 2) 中進(jìn)行了調(diào)整：酵母提取物和鼠李糖的接種量和濃度。 DoE 2 中的收獲時(shí)間也有所不同，以探索更具經(jīng)濟(jì)效益的 8 小時(shí)培養(yǎng)是否足夠。所有其他因子保持不變。 DoE 2 具有使總 eGFP 產(chǎn)量平均比 LB 生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)照增加 2 倍的效果。第三次也是最后一次迭代 (DoE 3) 側(cè)重于關(guān)鍵工藝參數(shù)：鼠李糖和葡萄糖的濃度以及多個(gè)收獲點(diǎn)的搖動(dòng)速度。總體而言，結(jié)果表明，與 LB 對(duì)照相比，eGFP 產(chǎn)量增加了 5 倍。

與其他 DoE 方法相比可節(jié)省大量時(shí)間
除了將 eGFP產(chǎn)量提高 5 倍之外，將 Antha 軟件平臺(tái)與 MANTIS 液體處理器一起使用還可以顯著節(jié)省時(shí)間。與其他方法相比，例如將 Antha 與另一個(gè)移液機(jī)器人一起使用或在沒(méi)有 Antha 的情況下使用 MANTIS 液體處理器，將 Antha 與 MANTIS 液體處理器組合使用以計(jì)劃、執(zhí)行和匯總3次 DoE 迭代的數(shù)據(jù)可節(jié)省74%的時(shí)間。（參見圖 5）。因此，用戶可以更專注于設(shè)計(jì)和對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明。

圖5.與其他方法相比，Antha和MANTIS®可節(jié)省時(shí)間。將MANTIS®液體處理器和Antha軟件平臺(tái)結(jié)合起來(lái)，計(jì)劃、執(zhí)行和匯總3次DoE迭代的數(shù)據(jù)，與在使用Antha的前提下使用另一臺(tái)液體處理器的或在不使用Antha的前提下使用MANTIS®相比，在96個(gè)深孔板中進(jìn)行96次運(yùn)行篩選DoE，可節(jié)省高達(dá)74%的時(shí)間。（預(yù)計(jì)時(shí)間基于Antha的人工實(shí)施和模擬的內(nèi)部經(jīng)驗(yàn)）。

總結(jié)
DoE在生物過(guò)程優(yōu)化領(lǐng)域獲得了廣泛的關(guān)注，與OFAT方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。然而，DoE的實(shí)施帶來(lái)了一些挑戰(zhàn)，我們認(rèn)為通過(guò)結(jié)合Antha軟件平臺(tái)和MANTIS液體處理器可以顯著減少這些挑戰(zhàn)，如本研究所示。這種組合簡(jiǎn)化了DoE計(jì)劃和執(zhí)行，從根本上減少了所有流程優(yōu)化組中DoE實(shí)施的障礙。現(xiàn)在，結(jié)合使用Antha和MANTIS簡(jiǎn)化DoE的計(jì)劃和執(zhí)行，減少了這些障礙。 

通過(guò)調(diào)整本案例研究中描述的通用過(guò)程，從事生物制劑發(fā)現(xiàn)和上游過(guò)程開發(fā)的科學(xué)家可以使用DoE統(tǒng)計(jì)框架對(duì)其過(guò)程進(jìn)行更科學(xué)的理解：錯(cuò)誤更少，數(shù)據(jù)處理更精簡(jiǎn)，動(dòng)手時(shí)間更少，以及更快地獲得科學(xué)論斷。