羊奶營養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、鈣、維生素A和B，且易消化，脂肪含量高，特別適合生產(chǎn)奶酪及其他乳制品。發(fā)酵乳制品（包括開菲爾）含有豐富的生物活性肽，這些肽由天然蛋白質(zhì)釋放而來，對健康有益^[1,2]，如抗菌、降膽固醇、預(yù)防肥胖、控制血糖、抗高血壓、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗氧化活性、抗癌和抗過敏^[3,4,5]，具有重要的科學(xué)、醫(yī)學(xué)和商業(yè)價(jià)值[6]。據(jù)報(bào)道，綿羊奶和山羊奶富含諸多生物功能多肽，主要來源于 α-、β-和 κ-酪蛋白[7]。雖然奶源本身就含有很多生物活性肽，但在開菲爾發(fā)酵過程中微生物蛋白酶又進(jìn)一步增加了其他活性肽的數(shù)量。開菲爾菌種加入到乳源后通常需要發(fā)酵12至48小時(shí)，據(jù)悉尚未有文獻(xiàn)報(bào)道過羊奶開菲爾發(fā)酵乳中的多肽成分。

來自科爾多瓦大學(xué)生物與生物學(xué)分子系的Manuel J. Rodríguez-Ortega教授團(tuán)隊(duì)在“Identification of Potential Bioactive Peptides in Sheep Milk Kefir through Peptidomic Analysis at Different Fermentation Times”研究中對不同時(shí)間段的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了全面的多肽組分析，探究由于微生物蛋白酶水解而產(chǎn)生的多肽序列，并篩選了78條潛在的生物活性肽。該研究是首次通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來表征羊奶開菲爾發(fā)酵乳中生物活性肽的研究，加強(qiáng)了對該產(chǎn)品的潛在益處的認(rèn)識。

開菲爾菌發(fā)酵過程中不同物質(zhì)成分的變化
表1顯示了開菲爾發(fā)酵0-48h不同時(shí)間段的pH值、乳酸、乙醇、乳糖和 D-半乳糖濃度以及蛋白水解活性的變化。非發(fā)酵羊奶的pH值接近中性值（6.67），隨著發(fā)酵的進(jìn)行pH值逐漸變酸，發(fā)酵48小時(shí)后達(dá)到3.80。乳酸濃度在發(fā)酵12小時(shí)后增加了13倍，在12小時(shí)后（24小時(shí)）增加了一倍，此后乳酸濃度變化不大。非發(fā)酵乳中乙醇含量約為0.01％，發(fā)酵12小時(shí)后乙醇含量增加了8倍多，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行而持續(xù)增加，發(fā)酵48小時(shí)后，乙醇含量為2.8 g/L，相當(dāng)于乙醇含量接近0.3％。D-半乳糖的含量趨勢與乳酸非常相似，發(fā)酵12小時(shí)后，濃度增加了約12倍，發(fā)酵24小時(shí)后增加了17倍，在36小時(shí)達(dá)到峰值。然而，在發(fā)酵過程中乳糖的含量略有下降，但不明顯。作者還用OPA法測定了蛋白水解活性，以確定微生物蛋白酶的活性變化。與未發(fā)酵乳相比，發(fā)酵12小時(shí)后蛋白水解活性增加了一倍，在24和36小時(shí)又增加了20%，在48小時(shí)后達(dá)到最大值，與未發(fā)酵乳相比增加了約 3.6 倍。

羊奶開菲爾發(fā)酵過程的多肽組學(xué)分析
作者通過microLC–timsTOF Pro-MS/MS結(jié)合PEAKS Studio和PEAKS Online分析了用開菲爾菌發(fā)酵12、24、36 和 48 小時(shí)和對照組未發(fā)酵羊奶的多肽組變化，共鑒定到來源于11種不同蛋白質(zhì)的1942條肽段（圖1A），其中約91.7%的1780個(gè)肽段屬于羊奶中的四種酪蛋白（αs1、αs2、β和κ），此外還發(fā)現(xiàn)了另外七種至少鑒定到3條肽段的蛋白。然后，作者對比了高度相似的綿羊和山羊蛋白質(zhì)發(fā)酵多肽產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)開菲爾菌針對不同物種的同一種蛋白質(zhì)的水解機(jī)制是不同的。

圖1B顯示了每個(gè)樣品中鑒定出的多肽的總數(shù)及其與11種蛋白質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系。12小時(shí)開菲爾發(fā)酵產(chǎn)物與對照組之間差異不大（878 vs 864）。微生物水解羊奶蛋白產(chǎn)生的多肽總數(shù)在發(fā)酵24小時(shí)后開始增加，48小時(shí)后達(dá)到1185，比未發(fā)酵樣品增加了35%。與對照組相比，發(fā)酵48小時(shí)后β-酪蛋白肽增加了19%（從434增加到 516），αs1-酪蛋白肽增加了35%（從155增加到210），αs2-酪蛋白增加了47%（從137增加到202），κ-酪蛋白增加了133%（從79增加到184），血清淀粉樣蛋白A增加了59%（從22增加到35）。然而，β-乳球蛋白和骨橋蛋白在發(fā)酵樣品中的肽數(shù)量均低于非發(fā)酵乳。對照組中沒有鑒定到α-乳清蛋白肽，但發(fā)酵36和48小時(shí)后檢測到。血清白蛋白肽只在非發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原α鏈以及β-2-微球蛋白肽則在對照組和部分發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)。不過，不能排除這些低豐度肽未檢測到是收到其高豐度蛋白的影響。

微生物蛋白酶對羊乳蛋白的水解機(jī)制
作者將鑒定到的多肽與羊奶中主要的四個(gè)酪蛋白（β、αS1、αS2和κ）序列進(jìn)行比對，以觀察開菲爾菌對乳蛋白的水解模式。從圖3可以看出，不同蛋白的消化模式并不統(tǒng)一。β-酪蛋白水解程度最高，其中Q34-F52、T78-F119、L 139-S161三個(gè)區(qū)域產(chǎn)生的多肽隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加。V162-F188之間的區(qū)域釋放的多肽數(shù)量差異不大。此外，與非發(fā)酵乳相比，發(fā)酵產(chǎn)物在E2-K28、Q56-P76和P194-P204區(qū)域鑒定到的多肽數(shù)量略有減少。對于αs1-酪蛋白，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，R22-N36和I37-M60兩個(gè)連續(xù)區(qū)域釋放的多肽數(shù)量明顯增多。發(fā)酵0h和12h的樣品中K124-Q172區(qū)域內(nèi)未檢測到任何多肽，發(fā)酵24h后該區(qū)域釋放的多肽數(shù)量略有增加，G63-K79區(qū)域釋放的多肽數(shù)量隨發(fā)酵進(jìn)行而減少。對于αs2-酪蛋白而言，N84-P119和T152-N200兩個(gè)區(qū)域釋放的多肽數(shù)量隨著發(fā)酵而增加，而E9-E24和Q128-K151兩個(gè)區(qū)域則減少。對于κ-酪蛋白，F(xiàn)18-L74和A96-K116之間的區(qū)域隨著發(fā)酵進(jìn)行，多肽釋放量顯著增加。相反，在S127-N143之間多肽釋放量減少。此外，在A144-C末端之間，在未發(fā)酵乳中檢測到的肽數(shù)量高于在發(fā)酵12小時(shí)的乳中檢測到的肽數(shù)量。從這些結(jié)果得出的一般結(jié)論是，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，羊奶中主要酪蛋白多肽的水解模式有顯著差異，但不同蛋白受到的影響程度并不相同，從而顯示出對微生物蛋白酶作用的敏感程度不同。
篩選潛在的生物活性肽
隨后，作者在9個(gè)在線活性肽數(shù)據(jù)庫中搜索了本次質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)所鑒定的羊奶開菲爾肽，并僅保留與數(shù)據(jù)庫中100%同源的活性多肽，結(jié)果共篩選出78 條潛在活性肽（表2），這些多肽都來源于四種主要酪蛋白。據(jù)相關(guān)報(bào)道，這些潛在生物活性肽大部分僅具有ACE抑制活性，但其中一些還具抗菌、抗炎或免疫調(diào)節(jié)等功能，五種肽具有抗氧化活性，一種肽具有抗血栓活性，另一種肽具有抗菌活性。在 78種生物肽中，有7種已在牛奶開菲爾發(fā)酵乳中被報(bào)道過^[8,9]，12種與之前在山羊奶開菲爾發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)的肽完全一致^[10,11,12]。

小結(jié)
作者鑒定了開菲爾菌對11種乳蛋白水解釋放的近2000種肽，其中大多數(shù)肽來自四種主要乳酪蛋白，占總?cè)榈鞍棕S度的80%左右^[13,14]，β-酪蛋白的水解肽數(shù)量最多。篩選出的78 種活性肽中，有55種在對照組中不存在，表明這些多肽是在發(fā)酵過程中因微生物蛋白酶的特殊作用而出現(xiàn)的，且對人體健康有益。該研究首次對不同發(fā)酵時(shí)間收集的羊奶開菲爾乳的多肽組進(jìn)行全面分析，該分析有助于了解隨著發(fā)酵過程的推進(jìn)，羊奶蛋白質(zhì)消化模式和多肽成分的變化。在發(fā)酵過程中會(huì)出現(xiàn)具有多種生物學(xué)特性的生物活性肽，這些活性肽隨時(shí)間而變化，時(shí)間越長，含量越高。但仍需進(jìn)一步研究以了解這些活性肽是否以及如何在體內(nèi)保持活性，尤其是在胃腸消化后。

原文鏈接：https://www.mdpi.com/2304-8158/12/15/2974

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