在ELISA試劑盒的使用過(guò)程中，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為了有效識(shí)別樣品配方與試劑盒組分之間的兼容性，加標(biāo)回收這一關(guān)鍵驗(yàn)證試驗(yàn)顯得尤為重要。它不僅是評(píng)估ELISA試劑盒準(zhǔn)確性的重要工具，也是滿足法規(guī)和藥典（如ICH或FDA指南等）對(duì)商品化ELISA試劑盒方法學(xué)驗(yàn)證要求的可靠方式。

什么是加標(biāo)回收？
加標(biāo)回收就是將已知量的標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中（“加標(biāo)”，spiking），通過(guò)對(duì)比加入前后的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估“回收”（recovery）測(cè)量值的準(zhǔn)確性。這一過(guò)程可以揭示樣品及其緩沖液中某些成分是否會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果。目前，影響ELISA試劑盒定量結(jié)果的常見(jiàn)因素包括極端pH、去污劑、有機(jī)溶劑、高蛋白質(zhì)濃度以及高鹽濃度等。因此，在進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)之前，確保排除這些干擾因素是至關(guān)重要的。

如何判定干擾因素？
樣品或緩沖液中的某些成分可能會(huì)影響HCP或其他雜質(zhì)的檢測(cè)與定量，導(dǎo)致回收結(jié)果的高估或低估，由此說(shuō)明樣品中存在干擾因素。同樣，上游收獲物和過(guò)程樣品的基質(zhì)中也可能存在疑似干擾 ELISA 檢測(cè)的成分。
在有干擾的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常表現(xiàn)為回收率偏低。但是，如果藥物本身或其他基質(zhì)組分與捕獲或檢測(cè)抗體有相互作用，則可能表現(xiàn)為回收率偏高。
此外，非特異性干擾，如試劑與孔板的結(jié)合，也會(huì)導(dǎo)致OD值偏高。通過(guò)合理控制實(shí)驗(yàn)流程，可以找出具體的干擾因素。

何時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)？
在進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)前，需要先完成樣品的稀釋線性分析，只有明確了最低需求稀釋倍數(shù)（MRD），加標(biāo)回收分析才有意義。（稀釋線性分析的詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考《HCP ELISA方法驗(yàn)證——稀釋線性dilution linearity》）
（Tips：每種類型的樣品基質(zhì)都需要進(jìn)行加標(biāo)回收分析。同時(shí)如果實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行了優(yōu)化，則需要重復(fù)此實(shí)驗(yàn)以確保檢測(cè)的有效性。）

如何執(zhí)行加標(biāo)回收分析？
樣品制備：

• 加標(biāo)樣品：可以設(shè)定3-4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到不同類型待檢樣品中，制備成加標(biāo)樣品，需要注意的是加標(biāo)樣品的濃度需在滿足MRD的條件下進(jìn)行分析，也就是最低加標(biāo)濃度不能低于LOQ的兩倍。
• 對(duì)照樣品：按相同體積比在每種待檢樣品中加入樣品稀釋液，制備成對(duì)照樣品，用于測(cè)定樣品本底的HCP濃度。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
使用ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)加標(biāo)樣品和對(duì)照樣品，每個(gè)樣品最好做3個(gè)重復(fù)孔，以計(jì)算均值。
結(jié)果分析：
回收率計(jì)算公式：
如下表案例所示，我們使用大腸桿菌HCP ELISA試劑盒（F410）分別檢測(cè)加標(biāo)樣品（100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品與樣品按1:4體積比混合，加標(biāo)濃度為20 ng/mL）和對(duì)照樣品（樣品稀釋液與樣品按1:4體積比混合），通過(guò)測(cè)得的HCP濃度計(jì)算出回收率為95%。
 

樣品	加標(biāo)濃度 （ng/mL）	HCP檢測(cè)濃度(ng/mL)	回收率
加標(biāo)樣品	20	25	95% [(25-6)/20]
對(duì)照樣品	0	6	NA

依據(jù)ICH、FDA及EMA等分析方法驗(yàn)證指南要求，HCP加標(biāo)回收率的可接受范圍應(yīng)在75%~125%。
為了方便您快速了解如何用4倍稀釋法制備加標(biāo)樣品和ELISA布板的詳細(xì)步驟，可觀看操作視頻：【技術(shù)在線】HCP ELISA方法驗(yàn)證——加標(biāo)回收（Spike & Recovery）

加標(biāo)回收問(wèn)題排查
如果加標(biāo)回收數(shù)據(jù)顯示出明顯的產(chǎn)物或基質(zhì)干擾，您可能需要通過(guò)進(jìn)一步稀釋樣品或置換緩沖液等方式來(lái)獲取準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。理想情況下，請(qǐng)選擇與標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液進(jìn)行樣品稀釋，這樣可以最大限度地減少偏差。在某些情況下，調(diào)整檢測(cè)方法也許能提高特定樣品類型的準(zhǔn)確性，但請(qǐng)務(wù)必謹(jǐn)慎操作，以免影響結(jié)果的可靠性。
為了全力支持客戶進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證及方法學(xué)開發(fā)，Cygnus為每款ELISA試劑盒都配備了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，詳情請(qǐng)查閱下表。

貨號(hào)	品名	規(guī)格	適用的試劑盒貨號(hào)
F553H-1	CHO HCP Antigen Concentrate, 3G	400 µl	F550-1
F1048X	CHO Lysate HCP Antigen Concentrate	200 uL	F1045
F1023X	E. coli HCP 2G Antigen Concentrate	200 uL	F1020
F1063X	BL21(DE3) HCP Antigen Concentrate	200 µl	F1060
F653SX	HEK 293 Antigen Concentrate	250 µl	F650S
F1043X	Sf9 HCP 3G Antigen Concentrate	200 µl	F1040
F1018X	P. pastoris HCP Antigen Concentrate	200 µl	F1015
F143U	P. pastoris Antigen Concentrate	200 µl	F140/F640
F978X	Vero Cell 2G HCP Antigen Concentrate	400 µl	F975
F1058X	PER.C6 HCP 2G Antigen Concentrate	200 µl	F1055
F1033X	SP2/0 HCP 2G Antigen Concentrate	200 uL	F1030
F998X	PG13 HCP Antigen Concentrate	200 uL	F995
F493G	L. lactis HCP Antigen Concentrate	200 µl	F490
F233G	A549 Antigen Concentrate	200 µl	F230
F813X	HeLa Antigen Concentrate	1 ml	F810
F803X	MDCK Antigen Concentrate	1 ml	F800
F513G	BHK HCP Antigen Concentrate	1 ml	F510
F227C	NS/0 Antigen Concentrate	1 ml	F220
F453X	P. fluorescens Antigen Concentrate	1 ml	F450
F823X	CAP® Antigen Concentrate	400 µl	F820
F1028X	C1 HCP Antigen Concentrate	200 uL	F1025
F603X	Protein A Antigen Concentrate	250 µl	F600
F613X	Protein A Antigen Concentrate	250 µl	F610
F403H	Protein A Antigen Concentrate	200 µl	F400
F044	Protein A Concentrate	200 µl	F050/F050H
F740-C	Amsphere™ A3 Ligand Protein A Control	250 µl	F740
F968X	Avantor J.T.Baker® BAKERBOND® PROchievA™ Protein A Antigen Concentrate	250 µl	F965
F743X	Amsphere™ A3 Ligand Protein A Antigen Concentrate	300 µl	F740
F1068X	Protein L Antigen Concentrate	200 µl	F1065
F963X	EndonucleaseGTP® Antigen Concentrate	500 µl	F960
F031G	BSA Antigen Concentrate	1 ml	F030

 
雖然加標(biāo)回收可以驗(yàn)證HCP ELISA的準(zhǔn)確性，但這只是整體方法學(xué)驗(yàn)證的一部分。完整的驗(yàn)證過(guò)程仍需包括精密度、LOD、LLOQ、ULOQ和HCP抗體覆蓋率等分析。Cygnus針對(duì)每一種檢測(cè)試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息索取，或直接聯(lián)系Cygnus中國(guó)總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過(guò)程中遇到任何問(wèn)題，我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)將竭誠(chéng)為您提供解決方案和建議。
  Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過(guò)25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測(cè)超過(guò)50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過(guò)95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。 北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國(guó)總代理，與國(guó)內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長(zhǎng)久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來(lái)西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。北京西美杰是Cygnus代理，Cygnus中國(guó)代理，Cygnus北京代理，Cygnus總代理，Cygnus上海代理，，Cygnus西北代理，Cygnus西南代理，Cygnus東北代理，Cygnus華北代理，Cygnus華南代理，Cygnus華中代理，負(fù)責(zé)Cygnus在中國(guó)的相關(guān)業(yè)務(wù)。