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LER現(xiàn)象揭秘之細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)中的假陰性風(fēng)險(xiǎn)與應(yīng)對(duì)措施
自2013年以來(lái)，“低內(nèi)毒素回收”（LER）現(xiàn)象在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。LER描述了在含有螯合緩沖液和聚山梨醇酯的未稀釋單克隆抗體制劑中，觀察到的鱟試劑（LAL）檢測(cè)干擾（抑制）。這一現(xiàn)象引發(fā)了關(guān)于病患者安全和藥典細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試在檢測(cè)生物制品中低水平內(nèi)毒素污染有效性方面的廣泛討論。
一、內(nèi)毒素與LPS的基本概念
在討論LER現(xiàn)象時(shí)，首先需要明確“內(nèi)毒素”和“脂多糖”（LPS）的概念。
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞膜的成分，而LPS是內(nèi)毒素復(fù)合物的特定成分，包括脂質(zhì)A部分，它會(huì)引起哺乳動(dòng)物的致熱反應(yīng)，并在LAL測(cè)試中引發(fā)信號(hào)產(chǎn)生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質(zhì)A）嵌入細(xì)胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細(xì)胞外環(huán)境。
二、LER現(xiàn)象的生化與物理基礎(chǔ)
美國(guó)藥典（USP）內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和目前與LAL檢測(cè)試劑盒相關(guān)的所有市售內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸”LPS制劑。
在LAL試驗(yàn)中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當(dāng)再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優(yōu)化LPS的聚集狀態(tài)以進(jìn)行試驗(yàn)。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會(huì)導(dǎo)致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態(tài)，進(jìn)而降低其生物活性，出現(xiàn)LER現(xiàn)象。
三、LER現(xiàn)象對(duì)患者安全與藥典測(cè)試的影響
LER現(xiàn)象可能導(dǎo)致LAL檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而對(duì)患者安全構(gòu)成隱患。然而，經(jīng)過(guò)改進(jìn)的工藝控制加上有效的LAL檢測(cè)，在工藝過(guò)程和釋放檢測(cè)中都很好地保證了這些生物制劑的供應(yīng)安全。
此外，歐盟委員會(huì)（EC）和美國(guó)藥典（USP）的專(zhuān)家委員會(huì)也對(duì)LER現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究，并認(rèn)為當(dāng)前的藥典測(cè)試方法對(duì)于檢測(cè)生物制品中的內(nèi)毒素污染是有效的。
四、LER現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)研究與數(shù)據(jù)支持
多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，LER現(xiàn)象并不是LAL測(cè)試有效性的問(wèn)題，而是用作對(duì)照的加標(biāo)分析物的選擇以及保持時(shí)間研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的問(wèn)題。
例如，在一項(xiàng)LER制劑保持時(shí)間研究中，同時(shí)進(jìn)行了兔子熱原測(cè)試（RPT）和LAL檢測(cè)，并使用內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和各種實(shí)驗(yàn)室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌）作為加標(biāo)分析物。在研究開(kāi)始時(shí)（T=0），所有加標(biāo)制劑在RPT中產(chǎn)生類(lèi)似熱原反應(yīng)，且在LAL試驗(yàn)中完全檢測(cè)到。在保持24小時(shí)后，囊泡制劑在RPT中仍有反應(yīng)，LAL檢測(cè)回收正常；但RSE在兔熱原試驗(yàn)和LAL檢測(cè)中均無(wú)反應(yīng)，顯示了LER現(xiàn)象的存在。
此外，已發(fā)表的數(shù)據(jù)也表明，在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，使用天然內(nèi)毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應(yīng)。
五、總結(jié)
LER現(xiàn)象揭示了LPS和內(nèi)毒素雖然在化學(xué)、結(jié)構(gòu)和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應(yīng)。因此，在使用“內(nèi)毒素”一詞時(shí)，必須明確其含義。此外，針對(duì)LER現(xiàn)象的研究也促使USP提出了一種由天然內(nèi)毒素組成的新型“天然內(nèi)毒素”（NOE）標(biāo)準(zhǔn)制劑，以更好地模擬天然內(nèi)毒素污染的情況，并進(jìn)一步提高LAL檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
LER現(xiàn)象是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，涉及多個(gè)方面的因素。然而，經(jīng)過(guò)深入研究和實(shí)踐驗(yàn)證，當(dāng)前的LAL檢測(cè)方法在檢測(cè)生物制品中的內(nèi)毒素污染方面仍然是有效的。未來(lái)，隨著對(duì)LER現(xiàn)象和NOE標(biāo)準(zhǔn)制劑的進(jìn)一步研究，我們將有望進(jìn)一步提高內(nèi)毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。
一、內(nèi)毒素與LPS的基本概念
在討論LER現(xiàn)象時(shí)，首先需要明確“內(nèi)毒素”和“脂多糖”（LPS）的概念。
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞膜的成分，而LPS是內(nèi)毒素復(fù)合物的特定成分，包括脂質(zhì)A部分，它會(huì)引起哺乳動(dòng)物的致熱反應(yīng)，并在LAL測(cè)試中引發(fā)信號(hào)產(chǎn)生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質(zhì)A）嵌入細(xì)胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細(xì)胞外環(huán)境。
二、LER現(xiàn)象的生化與物理基礎(chǔ)
美國(guó)藥典（USP）內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和目前與LAL檢測(cè)試劑盒相關(guān)的所有市售內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸”LPS制劑。
在LAL試驗(yàn)中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當(dāng)再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優(yōu)化LPS的聚集狀態(tài)以進(jìn)行試驗(yàn)。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會(huì)導(dǎo)致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態(tài)，進(jìn)而降低其生物活性，出現(xiàn)LER現(xiàn)象。
三、LER現(xiàn)象對(duì)患者安全與藥典測(cè)試的影響
LER現(xiàn)象可能導(dǎo)致LAL檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而對(duì)患者安全構(gòu)成隱患。然而，經(jīng)過(guò)改進(jìn)的工藝控制加上有效的LAL檢測(cè)，在工藝過(guò)程和釋放檢測(cè)中都很好地保證了這些生物制劑的供應(yīng)安全。
此外，歐盟委員會(huì)（EC）和美國(guó)藥典（USP）的專(zhuān)家委員會(huì)也對(duì)LER現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究，并認(rèn)為當(dāng)前的藥典測(cè)試方法對(duì)于檢測(cè)生物制品中的內(nèi)毒素污染是有效的。
四、LER現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)研究與數(shù)據(jù)支持
多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，LER現(xiàn)象并不是LAL測(cè)試有效性的問(wèn)題，而是用作對(duì)照的加標(biāo)分析物的選擇以及保持時(shí)間研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的問(wèn)題。
例如，在一項(xiàng)LER制劑保持時(shí)間研究中，同時(shí)進(jìn)行了兔子熱原測(cè)試（RPT）和LAL檢測(cè)，并使用內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和各種實(shí)驗(yàn)室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌）作為加標(biāo)分析物。在研究開(kāi)始時(shí)（T=0），所有加標(biāo)制劑在RPT中產(chǎn)生類(lèi)似熱原反應(yīng)，且在LAL試驗(yàn)中完全檢測(cè)到。在保持24小時(shí)后，囊泡制劑在RPT中仍有反應(yīng)，LAL檢測(cè)回收正常；但RSE在兔熱原試驗(yàn)和LAL檢測(cè)中均無(wú)反應(yīng)，顯示了LER現(xiàn)象的存在。
此外，已發(fā)表的數(shù)據(jù)也表明，在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，使用天然內(nèi)毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應(yīng)。
五、總結(jié)
LER現(xiàn)象揭示了LPS和內(nèi)毒素雖然在化學(xué)、結(jié)構(gòu)和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應(yīng)。因此，在使用“內(nèi)毒素”一詞時(shí)，必須明確其含義。此外，針對(duì)LER現(xiàn)象的研究也促使USP提出了一種由天然內(nèi)毒素組成的新型“天然內(nèi)毒素”（NOE）標(biāo)準(zhǔn)制劑，以更好地模擬天然內(nèi)毒素污染的情況，并進(jìn)一步提高LAL檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
LER現(xiàn)象是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，涉及多個(gè)方面的因素。然而，經(jīng)過(guò)深入研究和實(shí)踐驗(yàn)證，當(dāng)前的LAL檢測(cè)方法在檢測(cè)生物制品中的內(nèi)毒素污染方面仍然是有效的。未來(lái)，隨著對(duì)LER現(xiàn)象和NOE標(biāo)準(zhǔn)制劑的進(jìn)一步研究，我們將有望進(jìn)一步提高內(nèi)毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。
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