靶基因甲基化測序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的炎癥性皮膚疾病，特征為劇烈瘙癢、復發(fā)性濕疹樣病變和Th2介導的免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg）在調(diào)控炎癥、抑制Th2細胞(T helper 2 cell)和維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。先前的研究對于AD患者中Treg比例存在沖突結(jié)果，一些研究發(fā)現(xiàn)Treg比例未改變，而其他研究則報告Treg數(shù)量增加。在過敏性疾病中，Treg對Th2細胞的抑制作用被破壞以及Th2型炎癥的促進背后的精確分子機制尚不清楚。因此，探究AD中Treg數(shù)量和功能變化背后的分子機制至關(guān)重要。
近日，南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院梁云生課題組探討了在特應(yīng)性皮炎（AD）中，Treg數(shù)量和功能變化的分子機制，以及這些變化如何影響Th2型炎癥。相關(guān)研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”為題發(fā)表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通過流式細胞術(shù)、mRNA測序（mRNA-seq）、共培養(yǎng)實驗、共免疫沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀和亞硫酸鹽測序（BS-seq）等方法，在體外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子機制。分析結(jié)果表明在輕度和中度AD中檢測到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg數(shù)量和CTLA-4表達特征性減少則與血清IL-4 (interleukin-4)水平相關(guān)，這與體外高濃度IL-4處理下的驗證分析結(jié)果一致。其背后機制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來抑制Foxp3和CTLA-4位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。高水平的IL-4破壞了Treg通過CTLA-4介導的Th2細胞分化抑制，而在Treg中阻斷IL-4Rα信號恢復了AD模型小鼠和AD患者的Treg數(shù)量和Th2細胞抑制。
總之，本研究結(jié)果表明，Treg數(shù)量及AD患者嚴重程度分級與血清IL-4水平相關(guān)。異常高水平IL-4表觀遺傳調(diào)控Treg數(shù)量和CTLA-4表達減少。IL-4誘導Treg上的CTLA-4表達減少損害了Th2細胞分化抑制。
研究方法
結(jié)果圖形
（1）Treg數(shù)量與AD嚴重程度分級和血清中IL-4水平相關(guān)。IL-4導致重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達減少。
B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年齡性別匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表達（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中篩選）的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表達與血清IL-4水平之間的相關(guān)性。
E. 培養(yǎng)的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T細胞中篩選）、CTLA-4+表達（在CD4+ T細胞中篩選）的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信號通路如何通過招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）和組蛋白去乙�；�2（HDAC2）來抑制Foxp3和CTLA-4基因位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
圖2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來抑制Foxp3和CTLA-4位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。從健康志愿者（HV）的外周血單個核細胞（PBMCs）中純化出初始T細胞，并在體外用IL-2/TGFβ1培養(yǎng)4天，然后有或沒有高濃度IL-4刺激額外3天。
A. 聚類熱圖顯示培養(yǎng)的Treg中轉(zhuǎn)錄因子差異表達，其中深紅色表示高基因表達水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位點的CpG DNA甲基化，以分析IL-4處理/未處理組Treg的甲基化狀態(tài)。圖表顯示通過亞硫酸鹽測序鑒定的DNA甲基化數(shù)量。
D. 收集Treg細胞、裂解，并用抗pSTAT6抗體免疫沉淀（IP）。通過免疫印跡法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗體。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3啟動子和CNS2的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。
F. Treg被轉(zhuǎn)染HDAC2 siRNA或?qū)φ誷iRNA，并在體外用IL-2/TGFβ1培養(yǎng)4天，然后有或沒有高濃度IL-4刺激額外3天。代表性的流式細胞術(shù)和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表達。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3和CTLA-4啟動子的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。每組n=3，三個重復。
（3）高水平IL-4破壞了CTLA-4介導的Treg對Th2細胞分化的抑制作用。
B. Teffs中IL-4表達的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。每組n=3，三個重復。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破壞了Treg對Th2型炎癥的抑制作用。
B-C. 第16天從整個耳朵和血液中IL-4+表達的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
D-E. 第16天從整個耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表達的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。每組n=3只小鼠，三個重復。
（5）達必妥(Dupilumab) 恢復了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達，并抑制Th2型炎癥。
圖5. Dupilumab恢復了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達及其對Th2炎癥的抑制作用。
A. 在不同時間點對AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
C. 在不同時間點對Th2細胞的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
易小結(jié)
參考文獻：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
近日，南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院梁云生課題組探討了在特應(yīng)性皮炎（AD）中，Treg數(shù)量和功能變化的分子機制，以及這些變化如何影響Th2型炎癥。相關(guān)研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”為題發(fā)表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通過流式細胞術(shù)、mRNA測序（mRNA-seq）、共培養(yǎng)實驗、共免疫沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀和亞硫酸鹽測序（BS-seq）等方法，在體外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子機制。分析結(jié)果表明在輕度和中度AD中檢測到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg數(shù)量和CTLA-4表達特征性減少則與血清IL-4 (interleukin-4)水平相關(guān)，這與體外高濃度IL-4處理下的驗證分析結(jié)果一致。其背后機制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來抑制Foxp3和CTLA-4位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。高水平的IL-4破壞了Treg通過CTLA-4介導的Th2細胞分化抑制，而在Treg中阻斷IL-4Rα信號恢復了AD模型小鼠和AD患者的Treg數(shù)量和Th2細胞抑制。
總之，本研究結(jié)果表明，Treg數(shù)量及AD患者嚴重程度分級與血清IL-4水平相關(guān)。異常高水平IL-4表觀遺傳調(diào)控Treg數(shù)量和CTLA-4表達減少。IL-4誘導Treg上的CTLA-4表達減少損害了Th2細胞分化抑制。
研究方法
- 研究隊列：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于實驗的特定基因敲除小鼠。
- 通過MC903誘導AD小鼠模型，評估耳厚度和組織學變化。
- 從人和小鼠樣本中分離和分化細胞，進行Treg抑制實驗和流式細胞術(shù)分析。
- 使用ELISA和Western blotting技術(shù)分析血清和蛋白表達水平。
- 通過亞硫酸鹽測序（Target-BS）和共免疫沉淀實驗分析DNA甲基化和蛋白相互作用。
- 進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位點的表觀遺傳修飾。
結(jié)果圖形
（1）Treg數(shù)量與AD嚴重程度分級和血清中IL-4水平相關(guān)。IL-4導致重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達減少。
圖1. IL-4水平增加導致重度AD患者中Treg數(shù)量和CTLA-4表達減少。
A. AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T細胞中篩選）的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年齡性別匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表達（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中篩選）的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表達與血清IL-4水平之間的相關(guān)性。
E. 培養(yǎng)的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T細胞中篩選）、CTLA-4+表達（在CD4+ T細胞中篩選）的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信號通路如何通過招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）和組蛋白去乙�；�2（HDAC2）來抑制Foxp3和CTLA-4基因位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
A. 聚類熱圖顯示培養(yǎng)的Treg中轉(zhuǎn)錄因子差異表達，其中深紅色表示高基因表達水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位點的CpG DNA甲基化，以分析IL-4處理/未處理組Treg的甲基化狀態(tài)。圖表顯示通過亞硫酸鹽測序鑒定的DNA甲基化數(shù)量。
D. 收集Treg細胞、裂解，并用抗pSTAT6抗體免疫沉淀（IP）。通過免疫印跡法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗體。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3啟動子和CNS2的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。
F. Treg被轉(zhuǎn)染HDAC2 siRNA或?qū)φ誷iRNA，并在體外用IL-2/TGFβ1培養(yǎng)4天，然后有或沒有高濃度IL-4刺激額外3天。代表性的流式細胞術(shù)和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表達。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3和CTLA-4啟動子的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。每組n=3，三個重復。
（3）高水平IL-4破壞了CTLA-4介導的Treg對Th2細胞分化的抑制作用。
圖3. 高水平IL-4破壞了CTLA-4介導的Treg對Th2細胞分化的抑制作用，OTII小鼠脾臟中分離的CTV標記的CD4+ CD25− Teffs和從BMDCs衍生的DCs與Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培養(yǎng)2天。
A. CTV標記的Teffs數(shù)量和定量。B. Teffs中IL-4表達的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。每組n=3，三個重復。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破壞了Treg對Th2型炎癥的抑制作用。
圖4. IL-4破壞了AD小鼠模型中Treg對Th2型炎癥的抑制作用。
A. 第16天用乙醇（EtOH）或MC903處理的小鼠耳朵的代表性圖像和組織學H&E染色結(jié)果。B-C. 第16天從整個耳朵和血液中IL-4+表達的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
D-E. 第16天從整個耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表達的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。每組n=3只小鼠，三個重復。
（5）達必妥(Dupilumab) 恢復了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達，并抑制Th2型炎癥。
圖5. Dupilumab恢復了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達及其對Th2炎癥的抑制作用。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
C. 在不同時間點對Th2細胞的代表性流式細胞術(shù)和定量分析。
易小結(jié)
- Treg數(shù)量和AD的嚴重程度分級與血清IL-4水平相關(guān)。
- 異常高水平的IL-4表觀遺傳調(diào)控Treg數(shù)量和CTLA-4表達減少。
- Treg中由IL-4誘導的CTLA-4表達減少破壞了Th2細胞分化抑制。
- 阻斷Treg中的IL-4Rα信號可以恢復Treg數(shù)量和對Th2型炎癥的抑制，為AD治療提供了新的策略和深入的機制理論。
參考文獻：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
標簽：
DNA甲基化
- 靶基因甲基化測序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
- ChIP等揭示糖皮質(zhì)激素和TET2共調(diào)控促進癌癥轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機制
- 游離細胞DNA（cfDNA）檢測整體研究方案及其應(yīng)用案例
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