01.技術(shù)簡(jiǎn)述
DNA 甲基化是一種表觀遺傳修飾，指DNA 分子在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下將甲基選擇性地添加到特定堿基上的過程。主要發(fā)生在胞嘧啶的CpG 位點(diǎn)，也可以在非CpG 位點(diǎn)和CpG 島中發(fā)生。DNA 甲基化參與調(diào)控基因表達(dá)、X 染色體失活、基因印記、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生以及維持基因組穩(wěn)定性。
 
02.技術(shù)優(yōu)勢(shì)
 
03.典型案例
案例1：Nature 項(xiàng)目：DNA 甲基化測(cè)序助力人多能干細(xì)胞向胚胎全能8細(xì)胞的人工誘導(dǎo)
期刊：Nature
影響因子：IF 50.5
樣本：人細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：RRBS、Micro-WGBS、scWGBS、scRNA-seq 等
本研究是應(yīng)用人多能干細(xì)胞向胚胎8 細(xì)胞狀態(tài)人工誘導(dǎo)的科研成果。研究者通過與胚胎發(fā)育8 細(xì)胞DNA 甲基化對(duì)比，探究e4CL 培養(yǎng)基用于8CLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，原始多能和全能性基因的甲基化變化情況。易基因運(yùn)用簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序(RRBS)、單細(xì)胞和微量細(xì)胞基因組DNA 甲基化測(cè)序等技術(shù)，完成了研究中不同人工干預(yù)及細(xì)胞狀態(tài)下的基因組DNA 甲基化的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。
 

圖：始發(fā)態(tài)PSC、4CL和8CLC微量/單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序甲基化水平分析
 

圖：DPPA3基因敲除后不同細(xì)胞甲基化變化[1]

案例2：Cell項(xiàng)目：微量DNA甲基化測(cè)序助力中國(guó)科學(xué)家成功構(gòu)建胚胎干細(xì)胞嵌合體猴
期刊：Cell
影響因子：IF 45.5
樣本：猴細(xì)胞
應(yīng)用技術(shù)：Micro-WGBS、scWGBS、scRNA-seq等
該研究在國(guó)際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴，并證實(shí)了猴胚胎干細(xì)胞可以高效地貢獻(xiàn)到胚外胎盤組織和生殖細(xì)胞。易基因?yàn)檠芯空咛峁┪⒘縒GBS測(cè)序分析，從表觀遺傳學(xué)層面證明發(fā)育過程中DNA甲基化的調(diào)控作用。
 

左圖：在不同條件下以及不同培養(yǎng)期猴ESCs的表觀基因組特征
 

右圖：在1、3、7和10個(gè)傳代的原始條件和4CL原始條件下培養(yǎng)的ESC，在不同基因組區(qū)域，原始多能基因，原始多能性位點(diǎn)以及印記基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平[2]

案例3：WGBS項(xiàng)目：PM2.5引起男性生殖障礙的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制
期刊：Environment International
影響因子：IF 10.3
樣本：小鼠
應(yīng)用技術(shù)：WGBS、RNA-seq
本研究建立一個(gè)實(shí)時(shí)PM2.5暴露模型，揭示PM2.5暴露可能導(dǎo)致睪丸功能障礙，包括精子發(fā)生障礙和類固醇激素功能障礙。睪丸5-甲基胞嘧啶（5mC）全基因組水平降低表明DNA甲基化可能與PM2.5暴露誘導(dǎo)的睪丸損傷有關(guān)。全基因組甲基化分析揭示了睪丸DNA的基因組低甲基化，并在CAP組與UA組和FA組中發(fā)現(xiàn)1000多個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR），表明PM2.5暴露（即使低劑量）可以調(diào)控睪丸甲基化。甲基化和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析鑒定出一些關(guān)鍵甲基化基因和網(wǎng)絡(luò)，這些基因和網(wǎng)絡(luò)可能參與精子發(fā)生和類固醇激素合成。
 

圖：WGBS揭示PM2.5暴露誘導(dǎo)睪丸全基因組低甲基化
 

圖：WGBS和RNA-seq關(guān)聯(lián)分析[3]

案例4：PNAS項(xiàng)目：DNA甲基化保護(hù)早期胚胎線粒體基因組穩(wěn)定性
期刊：P NATL ACAD SCI USA（PNAS）
影響因子：IF 9.4
樣本：胚胎
應(yīng)用技術(shù)：MeDIP-seq、WGBS
本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)線粒體基因組經(jīng)歷了mtDNA從頭甲基化，可以保護(hù)mtDNA免受著床前窗口期間氧化增強(qiáng)的損傷。線粒體基因組在在由囊胚向附植后胚胎發(fā)育的過程中，發(fā)生廣泛的mtDNA甲基化，從而在囊胚的低甲基化狀態(tài)中建立相對(duì)高甲基化的mtDNA。揭示了關(guān)鍵圍發(fā)育期mtDNA甲基化動(dòng)態(tài)及其潛在機(jī)制，并揭示了線粒體表觀遺傳重塑與代謝變化之間的功能相關(guān)性，證明了核基因組-線粒體在建立線粒體表觀遺傳學(xué)和維持線粒體穩(wěn)態(tài)中的作用。
 

圖：E3.5、E7.5 和 E10.5 胚胎中小鼠線粒體基因組中檢測(cè)到的線性化 mtDNA甲基化
 

圖：先前發(fā)表的人和小鼠早期胚胎的線粒體DNA甲基化水平的WGBS分析 [4]

案例5：oxRRBS項(xiàng)目：復(fù)發(fā)性膀胱癌的DNA甲基化和羥甲基化變化圖譜和PD-L1表達(dá)標(biāo)記物預(yù)測(cè)
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 9.5
樣本：人膀胱癌組織
應(yīng)用技術(shù)：WES、RRBS、oxRRBS、RNA-seq
該研究通過全外顯子組測(cè)序（WES）、簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）+氧化簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（oxRRBS）及對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）等多組學(xué)方法揭示了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膀胱癌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜，并鑒定出用于預(yù)測(cè)PD-L1表達(dá)的生物標(biāo)志物。結(jié)果表明表觀遺傳變化比基因突變更早和更多參與UBC復(fù)發(fā)和PD-L1調(diào)控，證明了使用DNA甲基化標(biāo)記物預(yù)測(cè)膀胱癌患者免疫治療反應(yīng)的潛力。
 

圖：?jiǎn)螇A基分辨率對(duì)膀胱癌樣品進(jìn)行5mC和5hmC分析
 

圖：PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥的甲基化變化[5]

案例6：oxWGBS項(xiàng)目：宮頸癌發(fā)生過程中的表觀遺傳特征變化
期刊：Clinical & Translational Medicine
影響因子：IF 7.9
樣本：人 組織
應(yīng)用技術(shù)：WGBS、oxWGBS、RNA-seq
本研究選擇從健康宮頸到CIN到宮頸癌（CC）的一系列樣本，進(jìn)行全基因組亞硫酸鹽測(cè)序 (WGBS-seq)、oxWGBS-seq、RNA-seq 和組蛋白修飾數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，以確定CC特異性的潛在表觀遺傳生物標(biāo)記物。
 

圖：oxBS揭示宮頸癌發(fā)生過程中的DNA甲基化和羥甲基化水平變化[6]

案例7：hMeDIP-seq項(xiàng)目：鐵離子依賴表觀調(diào)控促進(jìn)狼瘡致病性T細(xì)胞分化
期刊：Journal of Clinical Investigation
影響因子：IF 13.3
樣本：人 組織
應(yīng)用技術(shù)：RNA-seq、MeDIP-seq、hMeMIP-seq、hMeMIP-qPCR
本研究首次揭示鐵離子過載通過調(diào)節(jié)DNA去甲基化促進(jìn)以濾泡輔助性T細(xì)胞為代表的致病性T細(xì)胞異常分化，從而加重自身免疫抗體產(chǎn)生及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病，提示T細(xì)胞內(nèi)鐵離子可能是治療SLE的新靶點(diǎn)。
 

圖：BCL6基因的5mC MeDIP-seq和5hmC hMeDIPseq的代表性IGV分析[7]

案例8：ACE-seq案例：無需亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化精準(zhǔn)區(qū)分甲基化和羥甲基化標(biāo)記
期刊：Nature Biotechnology
影響因子：IF 33.1
樣本：組織、血漿
應(yīng)用技術(shù)：ACE-seq
此研究建立一種利用DNA脫氨酶（APOBEC3A）實(shí)現(xiàn)的非破壞性的、低起始DNA量的鑒定5hmC技術(shù)（ACE-seq）。與傳統(tǒng)亞硫酸鹽測(cè)序（BS-Seq）不同，ACE-seq不依賴于亞硫酸鹽處理，而是通過酶促脫氨反應(yīng)來區(qū)分未修飾的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5mC），同時(shí)保護(hù)5hmC不被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。這種方法允許對(duì)cfDNA中的5hmC進(jìn)行精確的定位和定量分析。
 

圖：ACE-seq 測(cè)序的高準(zhǔn)確性[8]

04.易基因項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

05.參考文獻(xiàn)
① Mazid, M.A., Ward, C., Luo, Z. et al. Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage. Nature (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04625-0

② Cao, Jing, Wenjuan Li, Jie Li, Md. Abdul Mazid, Chunyang Li, Yu Jiang, Wenqi Jia, et al. 'Live Birth of Chimeric Monkey with High Contribution from Embryonic Stem Cells'. Cell 186, no. 23 (November 2023): 4996-5014.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.005.

③ Zhang Z, et al. Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure. Environ Int. 2022 Sep 24;169:107544.

④ Yue Y, et al. Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jul 26;119(30):e2201168119. doi: 10.1073/pnas.2201168119. PubMed PMID: 35858425.

⑤ Shi ZD, et al. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.

⑥Han Y, et al. An epigenomic landscape of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and hydroxymethylome. Clin Transl Med. 2021 Jul;11(7):e498. doi: 10.1002/ctm2.498. PubMed PMID: 34323415.

⑦Gao X,et al. Iron-dependent epigenetic modulation promotes pathogenic T cell differentiation in lupus. J Clin Invest. 2022 May 2;132(9) pii: 152345. doi: 10.1172/JCI152345. PubMed PMID: 35499082.

⑧ Schutsky EK, et al.Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat Biotechnol. 2018 Oct 8. pii: nbt.4204. doi: 10.1038/nbt.4204. PubMed PMID: 30295673.