Fig. 1. Wdr4突變引起發(fā)育、動作和智力缺陷

2. WDR4點(diǎn)突變導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和小頭畸形
如同臨床上的WDR4突變病人會出現(xiàn)小頭畸形，8周齡的突變小鼠相較于野生對照組，腦部尺寸和重量上也顯著降低，大腦皮層無顯著差異，但小腦萎縮嚴(yán)重，伴有小腦中凋亡細(xì)胞數(shù)目的顯著上調(diào)（Fig. 2A-H, L-N）�？紤]到突變小鼠在4周齡沒有形態(tài)、認(rèn)知和行為上的顯著缺陷，所以作者也對2周至8周之間的多個年齡時間點(diǎn)的小鼠小腦進(jìn)行了定量分析，可見突變型小鼠的小腦萎縮表型在5周（Day 35）后開始顯現(xiàn)，主要體現(xiàn)在小腦皮層中IGL（internal granule layer，內(nèi)部顆粒層）和ML（molecular layer，分子層）的面積顯著降低（Fig. 2I-K）。
 

Fig. 2. WDR4點(diǎn)突變引起神經(jīng)細(xì)胞死亡和小頭畸形

3. Wdr4突變小鼠腦部特定類型細(xì)胞隨時間退化
上述小腦萎縮的病理過程也暗示了METTL1/WDR4通過tRNA m⁷G調(diào)控腦部發(fā)育與穩(wěn)態(tài)的機(jī)制也可能具有時序上的特征。因此，作者在野生型小鼠中檢測了1日齡至8周齡之間多個時間點(diǎn)的METTL1和WDR4蛋白水平，發(fā)現(xiàn)二者在4周（Day 28）前隨時間逐漸升高，在Day 28左右達(dá)到峰值，隨后開始逐漸下降（Fig. 3A）。

為了在單細(xì)胞水平上探究Wdr4突變帶來的影響，作者選取8周齡（Day 56）小鼠進(jìn)行單細(xì)胞核測序（snRNA-seq；測序服務(wù)由伯豪生物提供），通過已知的腦部細(xì)胞marker對聚類后的數(shù)據(jù)進(jìn)行了注釋，并對在數(shù)量上占絕大多數(shù)的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的亞型細(xì)分與注釋（Fig. S2A, F, G; Fig. 3B）。在神經(jīng)元細(xì)分成的14個亞群中，Subcluster 0在突變小鼠中幾乎消失，該細(xì)胞亞型中，顆粒層細(xì)胞marker Gabra6和Etv1特異性高表，暗示了Wdr4點(diǎn)突變對小腦顆粒層細(xì)胞退化的特異性調(diào)控（Fig. 3B-D）。GO富集分析的結(jié)果顯示Subcluster0顯著下調(diào)的差異基因（DEGs）主要富集于神經(jīng)元形態(tài)異常和小腦形態(tài)異常等通路（Fig. 3E, F）。
 

Fig. 3. Wdr4點(diǎn)突變小鼠腦部出現(xiàn)特定細(xì)胞類型隨時間退化
 

Fig. S2. 2月齡小鼠腦部snRNA-seq分析

4. Wdr4點(diǎn)突變抑制其自身與METTL1的互作并降低METTL1穩(wěn)定性
以往的研究報道了METTL1/WDR4催化tRNA的m⁷G修飾這一機(jī)制，于是作者以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究METTL1和WDR4在突變小鼠中的表達(dá)情況。腦部的METTL1在小腦中高表而在其他區(qū)域的表達(dá)量較低（與小腦萎縮表型相符），Wdr4的點(diǎn)突變顯著下調(diào)了tRNA的m7G水平和METTL1的蛋白水平，但是對后者的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性的影響，而蛋白酶體抑制劑MG132的處理使得Wdr4突變的原代神經(jīng)細(xì)胞中METTL1的蛋白水平顯著上調(diào)，暗示了Wdr4點(diǎn)突變導(dǎo)致了METTL1蛋白的降解（Fig. 4A-E）。
 

Fig. 4. Wdr4點(diǎn)突變通過蛋白降解降低METTL1穩(wěn)定性

5. Wdr4點(diǎn)突變導(dǎo)致m⁷G tRNA修飾、mRNA翻譯下調(diào)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)
作者利用TRAC-seq進(jìn)一步探究Wdr4點(diǎn)突變對神經(jīng)退化的影響，篩選到了含有m⁷G修飾的tRNA基序“RRRGGT”，并發(fā)現(xiàn)了突變小鼠腦部tRNA m⁷G修飾水平的顯著下調(diào)，含m⁷G的tRNA水平下調(diào)但不含m⁷G的tRNA水平?jīng)]有顯著性變化（Fig. 5A-F）。嘌呤霉素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變小鼠的嘌呤霉素?cái)z入顯著降低，即翻譯水平顯著下調(diào)（Fig. 5G）。作者接著對野生型和突變小鼠的腦部進(jìn)行了多聚核糖體測序（Polysome-seq），以探究小鼠腦部mRNA的翻譯效率，結(jié)果顯示，在突變小鼠腦部翻譯效率下調(diào)的基因帶有更多的m⁷G tRNA攜帶的密碼子，且TE的變化率與m⁷G 密碼子出現(xiàn)的頻率、數(shù)目以及編碼序列的長度顯著相關(guān)（Fig. 5H, I; Fig. S4A-C）。

TRAC-seq結(jié)果中，翻譯效率下調(diào)的基因主要富集在細(xì)胞應(yīng)激、腦部發(fā)育和mTOR信號通路上，而RNA-seq的結(jié)果中又富集到了上調(diào)的細(xì)胞應(yīng)激通路，即細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的上調(diào)和翻譯水平上的下調(diào)（Fig. 5J-O）。此外Wdr4突變導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上的上調(diào)及該通路中關(guān)鍵分子IRE1和PERK的磷酸化水平上調(diào)，而降低PERK磷酸化水平則會同時使得促凋亡蛋白Bax和Bim的水平顯著下調(diào)（Fig. 5P, Q;Fig. S5）。另外，由于文獻(xiàn)報道過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與小膠質(zhì)細(xì)胞激活之間的關(guān)聯(lián)，所以作者也對此進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Ibal陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞在Day 35之后的突變小鼠小腦中快速擴(kuò)張，與突變小鼠自Day 35開始出現(xiàn)小腦萎縮的表型一致（Fig. 5R）。

綜上，作者證明了小鼠腦部的Wdr4點(diǎn)突變會下調(diào)tRNA在相應(yīng)位點(diǎn)的m⁷G修飾和mRNA翻譯，上調(diào)細(xì)胞應(yīng)激和凋亡。
 

Fig. 5. Wdr4點(diǎn)突變引起tRNA m⁷G修飾下調(diào)，mRNA翻譯水平下調(diào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)

6. 回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用前景
關(guān)于回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的部分，作者循序漸進(jìn)地設(shè)計(jì)了三種不同的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)：
首先是利用FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的可緩解細(xì)胞應(yīng)激的藥物TUDCA對突變小鼠進(jìn)行注射，注射治療后的突變小鼠在腦部形態(tài)和功能方面均有顯著的改善（Fig. S6）。
然而，盡管TUDCA的治療是有效的，但作者顯然不認(rèn)為這是一種很理想的治療方式，因?yàn)檫@樣的治療方式需要患者每天都注射TUDCA。所以作者設(shè)計(jì)了通過AAV-PHPeB轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型WDR4的來實(shí)現(xiàn)對突變小鼠進(jìn)行治療的方法，AAV-PHPeB對小鼠腦部的感染效率很高，同時也的確使得突變小鼠在接受治療后，腦部的形態(tài)和相應(yīng)功能得到了顯著的恢復(fù)（Fig. 6）。

最后，作者利用iPSC誘導(dǎo)獲得的人類神經(jīng)元干細(xì)胞（NSCs）進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行了TUDCA處理和野生型WDR4轉(zhuǎn)導(dǎo)治療，以評估這兩種治療方式對人類患者臨床上常見位點(diǎn)突變WDR4的效果和潛在臨床應(yīng)用價值。這兩種治療方式都可以顯著恢復(fù)WDR4突變的人類NSCs的增殖水平，并在分化的過程中緩解WDR4突變導(dǎo)致的凋亡（Fig. 7）。
 

Fig. S6. TUDCA治療tRNA m⁷G修飾下調(diào)小鼠的腦功能
 

Fig. 6. tRNA修飾下調(diào)小鼠的長期治療干預(yù)
 

Fig. 7. TUDCA治療或回補(bǔ)野生型WDR4提升帶有WDR4突變的人類iPSC來源的NSC存活率和功能

研究總結(jié)
本文的完成度很高，作者的邏輯線非常清晰，從表型到機(jī)制再到回補(bǔ)都有詳細(xì)深入嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶骄�，所有的�?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和機(jī)制探索都緊緊圍繞著臨床上的表型展開，這也讓文章的結(jié)論具有更大的可能被實(shí)際應(yīng)用在臨床治療中，不難看出作者背景知識和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面的能力相當(dāng)扎實(shí)。

本文中的snRNA-seq在本就完整連貫的故事鋪陳基礎(chǔ)上錦上添花，充分發(fā)揮了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的最主要優(yōu)勢，即精確區(qū)分細(xì)胞之間在轉(zhuǎn)錄水平上的細(xì)微差異，并通過這種差異準(zhǔn)確地找到了一種具有顯著差異且與表型高度吻合的細(xì)胞亞型，作為本文故事主線的補(bǔ)充，也是向著另一個研究視角支線的初步探索。當(dāng)然，本文的snRNA-seq數(shù)據(jù)中仍然有許多信息亟待挖掘和驗(yàn)證，或許未來可以進(jìn)一步地精準(zhǔn)地探明WDR4對作者發(fā)現(xiàn)的特定細(xì)胞類型/亞型的調(diào)控機(jī)制，或者WDR4對其他細(xì)胞類型/亞型存在的潛在調(diào)控等等，這些研究是一個逐漸發(fā)展的過程，所以這些就要期待作者或后人未來的研究了。