N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA中最普遍和豐富的修飾，通過“writer”（甲基轉(zhuǎn)移酶）、“eraser”（去甲基化酶）和“reader”（閱讀蛋白）動態(tài)調(diào)控mRNA代謝的幾乎每一步，并干擾多種生物過程。RNA甲基化是調(diào)控免疫細胞功能的重要過程，但其如何影響CD8 T細胞的抗腫瘤活性尚不完全清楚。
 
近日，澳門大學(xué)侯嘉杰教授和中山大學(xué)徐瑞華教授團隊合作研究了m6A RNA reader蛋白YTHDF2在CD8 T細胞中的表達上調(diào)和亞細胞定位如何決定其在抗腫瘤免疫中的多功能性。研究發(fā)現(xiàn)YTHDF2在早期效應(yīng)T細胞或效應(yīng)樣CD8 T細胞中高表達，并且對腫瘤進展和抗PD-1阻斷治療反應(yīng)有重要作用。相關(guān)研究成果以“YTHDF2 upregulation and subcellular localization dictate CD8 T cell polyfunctionality in anti-tumor immunity”為題發(fā)表在Nature子刊《Nature Communications》上。
 

標題：YTHDF2 upregulation and subcellular localization dictate CD8 T cell polyfunctionality in anti-tumor immunity（YTHDF2上調(diào)和亞細胞定位決定CD8 T細胞在抗腫瘤免疫中的多功能性）
期刊：Nature Communications
發(fā)表時間：2024年11月5日
技術(shù)平臺：m6A-seq、RIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq等（易基因金牌技術(shù)）
 
本研究首先揭示了m6A RNA reader蛋白YTHDF2在早期效應(yīng)或效應(yīng)樣CD8 T細胞中高表達。分析結(jié)果表明YTHDF2促進了新生RNA（nascent RNA）合成，而m6A識別對于蛋白質(zhì)特異性核功能至關(guān)重要，也加強了其在RNA水平上的自我調(diào)控。T細胞中YTHDF2缺失會加劇腫瘤進展，并導(dǎo)致對PD-1阻斷在小鼠和人類中的無反應(yīng)性。除了啟動對線粒體健康必要的RNA衰變外，YTHDF2還協(xié)調(diào)染色質(zhì)變化，促進T細胞的多功能性。YTHDF2與IKZF1/3互作，促進目標基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。因此，在YTHDF2缺失T細胞中，通過聯(lián)合使用IKZF1/3抑制劑來那度胺（lenalidomide），可以大幅恢復(fù)免疫療法誘導(dǎo)的療效，該療效在小鼠模型中得到驗證。總之，本研究結(jié)果表明YTHDF2協(xié)調(diào)表觀轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，以增強T細胞免疫，這可能為癌癥免疫治療提供新策略。
 
研究思路：

實驗方法：
樣本選擇：

• 動物模型：使用Ythdf2^Flox/Flox（Ythdf2^F/F）小鼠與dLckCre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，條件性敲除T細胞中的Ythdf2（Ythdf2^CKO）。
• 細胞培養(yǎng)：從小鼠脾臟組織分離外周naïve CD8 T細胞，進行體外激活和培養(yǎng)。
• 人類樣本：結(jié)直腸癌（CRC）和肝細胞癌（HCC）患者的組織樣本。

• 流式細胞術(shù)（Flow Cytometry）：分析和分選不同的T細胞亞群，包括腫瘤浸潤性T細胞。
• 免疫熒光染色：檢測YTHDF2和CD8在組織樣本中的表達和定位。
• 免疫共沉淀（IP）和質(zhì)譜分析（MS）：鑒定與YTHDF2互作的蛋白質(zhì)。
• RNA測序技術(shù)（RNA-seq）：分析基因表達變化和轉(zhuǎn)錄組分析。
• m6A測序技術(shù)（m6A-seq）：分析m6A甲基化水平變化。
• RNA免疫沉淀測序（RIP-seq）：分析YTHDF2結(jié)合的RNA。
• ATAC-seq：分析染色質(zhì)可及性，即基因組中開放染色質(zhì)區(qū)域的鑒定。
• CUT&RUN：分析特定蛋白質(zhì)在基因組上的結(jié)合位點。
• Ribo-seq：分析翻譯過程中的RNA分子。
• 電子顯微鏡技術(shù)：觀察線粒體的形態(tài)變化。

 
結(jié)果圖形：
（1）YTHDF2在早期效應(yīng)T細胞（T_eff）和類效應(yīng)T細胞中選擇性上調(diào)和重新分布。
 

圖1：YTHDF2在早期T_eff和類T_eff細胞中選擇性上調(diào)和重新分布。
 

a.  不同時間點激活或向耗竭/記憶階段分化的人CD8 T細胞中m6A修飾物的mRNA表達（GSE212357）。
b.  接受抗PD-1或cIg治療的小鼠肺腫瘤中的CD8 T細胞中m6A修飾物的mRNA表達（GSE114300）。
c. 在體外生成的效應(yīng)CD8 T細胞（T_eff，n=5個獨立樣本）和耗竭CD8 T細胞（T_ex，n=5個獨立樣本）中YTHDF2的平均熒光強度（MFI）。
d-e. 在接種B16F10-OVA腫瘤的小鼠的脾臟或腫瘤浸潤性T細胞亞群中YTHDF2的MFI，在腫瘤接種后第6天（n=5只小鼠）或第13天（n=5只小鼠）。 T_pex：祖細胞耗竭T細胞。T_mem：記憶T細胞。
f.  在接受抗PD-1或cIg治療的B16F10-OVA腫瘤中的CD8 T細胞亞群中YTHDF2的MFI（每組n=5只小鼠）。
g. 刺激的小鼠或人類CD8 T細胞的細胞質(zhì)和細胞核中YTHDF2的免疫印跡分析。
h.  naïve或激活的CD8 T細胞中YTHDF2（紅色）和DAPI（藍色）的代表性共聚焦免疫熒光圖像。
i.  在進展（n=5個獨立樣本）或縮小（n=5個獨立樣本）的B16-OVA腫瘤中CD8（紅色）和YTHDF2（綠色）的代表性免疫熒光染色。
j. 在接受抗PD-1或cIg治療的CD8 T_pex細胞中YTHDF2（紅色）和DAPI（藍色）的代表性共聚焦免疫熒光圖像（每組n=6個獨立樣本）。
 
（2）YTHDF2 對 CD8 T 細胞的抗腫瘤作用至關(guān)重要

圖2：YTHDF2對CD8 T細胞的抗腫瘤效應(yīng)至關(guān)重要。
 

a.  雄性Ythdf2^F/F（n=6）或Ythdf2^CKO（n=6）小鼠皮下注射10^6 Hepa1-6細胞。
b.  雌性Ythdf2^F/F（n=7）或Ythdf2^CKO（n=5）小鼠皮下注射5×10^5 B16F10細胞。
c.  雌性Ythdf2^F/F（n=5）或Ythdf2^CKO（n=5）小鼠皮下注射10^6 MC38細胞。每2或3天監(jiān)測一次腫瘤生長。
d-f.  從接種MC38腫瘤的Ythdf2^F/F（n=6）和Ythdf2^CKO（n=6）小鼠中分離出的腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL），在腫瘤接種后第12天，通過流式細胞術(shù)評估TIL中T細胞亞群（CD8、CD4和調(diào)節(jié)性（Treg）T細胞）的數(shù)量（d），以及CD8 T細胞亞群中CD44+、KLRG1+陽性（e）、活化caspase-3（Casp-3）、顆粒酶B（Gzm B）、干擾素-γ（IFN-γ）或Ki-67陽性的頻率（f）。
g.  從攜帶MC38腫瘤的Ythdf2 ^F/F（n=6）和Ythdf2^CKO（n=6）小鼠（第18天）中，通過流式細胞術(shù)評估PD-1+TIM3+CD101+的CD8 T細胞亞群頻率。
h.  將雌性Ythdf2^F/F;OT-1（n=8）或Ythdf2^CKO;OT-1（n=6）小鼠皮下注射10^6 B16F10-OVA細胞，并監(jiān)測腫瘤生長。
i.  采用PBS對照或OVA預(yù)激活的Ythdf2^F/F;OT-1或Ythdf2^CKO;OT-1 CD8 T細胞進行過繼轉(zhuǎn)移處理B16F10-OVA黑色素瘤（每組5只小鼠）。
j-k. 雌性Ythdf2^F/F（n=12）或Ythdf2 ^CKO（n=11）小鼠皮下注射10^6 MC38細胞（j）。雄性Ythdf2^F/F（n=16）或Ythdf2^CKO（n=12）小鼠皮下注射10^6 Hepa1-6細胞（k）。攜帶腫瘤的小鼠接受抗PD-1或cIg治療。
l. 從接種MC38腫瘤并接受抗PD-1治療的Ythdf2^F/F（n=6）和Ythdf2^CKO（n=6）小鼠中分離出的TIL，通過流式細胞術(shù)評估PD-1+Dextramer+、CX3CR1+Tim3+CD101-PD-1+ 的CD8 T細胞亞群頻率。
 
（3）YTHDF2通過m6A依賴性RNA衰變預(yù)防T細胞線粒體功能障礙
 

圖3：YTHDF2通過m6A依賴性RNA衰變預(yù)防線粒體應(yīng)激和T細胞耗竭。
 

a. 在激活的或Ythdf2^CKO CD8 T細胞（抗CD3/CD28，5μg/ml，24小時）中的差異mRNA表達基因火山圖（每個基因型2個樣本）。顯著上調(diào)或下調(diào)的基因分別用紅色或藍色點表示。在RIP-seq和m6A-seq中富集的潛在YTHDF2靶標用黃色圓圈標記。
b. 與Ythdf2^F/F CD8 T細胞相比，在Ythdf2^CKO CD8 T細胞中上調(diào)基因的GO富集分析（抗CD3/CD28，5μg/ml，24h后）。
c. 在激活的Ythdf2^F/F（5個獨立樣本）和Ythdf2^CKO（5個獨立樣本）CD8 T細胞中線粒體膜電位和線粒體質(zhì)量通過MitoTracker Orange（MO）和MitoTracker Green（MG）染色測量。線粒體健康狀況根據(jù)MO/MG比率評估。
d. 在Ythdf2^F/F（5只小鼠）或Ythdf2^CKO（5只小鼠）小鼠中激活的CD8 T細胞中線粒體活性氧（ROS）通過MitoSOX染色測量。
e. 在Ythdf2^F/F（5只小鼠）和Ythdf2^CKO（5只小鼠）小鼠的MC38腫瘤浸潤性CD8 T細胞中MitoSOX染色。
f. 在Ythdf2^F/F（5只小鼠）或Ythdf2^CKO（5只小鼠）小鼠的MC38腫瘤浸潤性CD8 T細胞中MG的MFI定量。
g, h. 在存在10 mΜ NAC或veh的情況下，Ythdf2^F/F（5個獨立樣本）和Ythdf2^CKO（5個獨立樣本）CD8 T細胞（抗CD3/CD28，5μg/ml，48小時）中Tim3+ PD-1+（g）和Zombie NIR+（h）頻率定量。
i. 熱圖顯示在激活的Ythdf2^F/F和Ythdf2^CKO CD8 T細胞中與線粒體相關(guān)且在Ythdf2CKO中上調(diào)的代表性基因相對表達。潛在的YTHDF2靶標用實心圓表示。
 
(4) YTHDF2螯合IKZF1/3以調(diào)控多功能CD8 T細胞中的活性染色質(zhì)狀態(tài)
 

圖4：YTHDF2螯合IKZF1/3以調(diào)控多功能CD8 T細胞活性染色質(zhì)狀態(tài)。

a. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）處理后，與Ythdf2^F/F相比，Ythdf2^CKO CD8 T細胞中下調(diào)基因的GO富集分析。
b. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）或OVA（10nM，24小時）刺激的小鼠（WT或OT-1）和人類CD8 T細胞中，YTHDF2與IKZF1或IKZF3相關(guān)聯(lián)的鄰近連接分析（PLA）分析。
c. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）處理的WT CD8 T細胞中，YTHDF2與IKZF1或IKZF3相關(guān)聯(lián)的共免疫沉淀實驗。
d. 在激活的Ythdf2^F/F和Ythdf2^CKO CD8 T細胞（抗CD3/CD28，5μg/ml，24小時）之間，基因的染色質(zhì)可及性差異火山圖。
e. 在Jurkat-shCtrl（Vec）和Jurkat-shYTHDF2（KD）細胞之間，基因的染色質(zhì)可及性差異火山圖。
f, g. 使用Cistrome Data Browser獲得的小鼠T細胞中IKZF1（GSM1296538）和IKZF3（GSM803106）的ChIP-seq數(shù)據(jù)集。在IKZF1/3結(jié)合位點或IKZF1/3相關(guān)啟動子上，激活的Ythdf2^F/F和Ythdf2^CKO CD8 T細胞的ATAC-seq（f）或H3K4me CUT&RUN（g）分析。
h. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）處理的激活的Ythdf2^F/F（n=3獨立樣本）和Ythdf2^CKO（n=3獨立樣本）CD8 T細胞中，通過RT-qPCR檢測的Stat5a（左）和Rasgrp1（右）mRNA水平。
i. 在激活的Ythdf2^F/F和Ythdf2^CKO CD8 T細胞中，Stat5a（上）和Rasgrp1（下）基因位點上的ATAC-seq和H3K4me CUT&RUN分析。
j. 熱圖顯示在激活的Ythdf2^F/F和Ythdf2^CKO CD8 T細胞中，RNA-seq數(shù)據(jù)中代表性基因（Ythdf2^CKO中下調(diào)）的相對表達。增強的染色質(zhì)可及性或潛在的IKZF1/3結(jié)合用實心圓表示。
 
（5）來那度胺挽救YTHDF2缺失型CD8 T細胞的多功能性
 

圖5：來那度胺恢復(fù)了YTHDF2缺失的CD8 T細胞的抗腫瘤功能。
 

a.  10 μΜ來那度胺（len）或載體對照（veh）情況下，對Ythdf2^F/F（n=5個獨立樣本）和Ythdf2^CKO（n=5個獨立樣本）CD8 T細胞進行抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）刺激，使用Click-it RNA成像分析新生RNA合成（綠色）。
b.  10 μΜ來那度胺或?qū)φ涨闆r下，對Ythdf2^F/F（n=4個獨立樣本）和Ythdf2^CKO（n=4個獨立樣本）CD8 T細胞進行抗CD3/CD28刺激，量化Ki-67 MFI。
c.  10 μΜ來那度胺或?qū)φ涨闆r下，對Ythdf2^F/F;OT-1（n=5個獨立樣本）和Ythdf2^CKO;OT-1（n=5個獨立樣本）CD8 T細胞進行OVA（10nM，24小時）刺激，使用Click-it RNA成像分析新生RNA合成（綠色）。
d.  10 μΜ來那度胺或?qū)φ涨闆r下，對Ythdf2^F/F;OT-1（n=5個獨立樣本）和Ythdf2^CKO;OT-1（n=5個獨立樣本）CD8 T細胞進行OVA（10nM，72小時）刺激，量化Ki-67 MFI。
e.  10 μΜ來那度胺或?qū)φ障�，對Ythdf2^F/F（n=4個獨立樣本）和Ythdf2^CKO（n=4個獨立樣本）CD8 T細胞進行抗CD3/CD28（5μg/ml，48小時）刺激，量化Gzm B和IFN-γ MFI。
f.   攜帶MC38腫瘤的Ythdf2^F/F（n=21）或Ythdf2^CKO（n=18）小鼠接受抗PD-1（250μg/只小鼠）和/或來那度胺（10mg/kg）治療，并監(jiān)測腫瘤生長。
g.  攜帶Hepa1-6腫瘤的Ythdf2^F/F（n=12）或Ythdf2^CKO（n=12）小鼠接受抗PD-1（250μg/只小鼠）和/或來那度胺（10mg/kg）治療，并監(jiān)測腫瘤生長。
h. 從攜帶Hepa1-6腫瘤的Ythdf2^F/F（n=6）或Ythdf2^CKO（n=6）小鼠中分離出的腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）中，量化Gzm B+ CD8 T或IFN-γ+ CD8 T的頻率，這些小鼠接受抗PD-1（250μg/只小鼠）和/或來那度胺（10mg/kg）治療（第13天）。
 
（6）YTHDF2依賴于m6A結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本進行核轉(zhuǎn)位（nuclear translocation）
 

圖6：m6A修飾機制調(diào)控YTHDF2的重新定位和表達。
 

a. 用或不用ActD（500μg/ml，4小時）處理的Jurkat細胞進行YTHDF2與IKZF3相關(guān)PLA分析。
b. 用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）刺激的Mettl3^F/F或Mettl3^CKO CD8 T細胞的細胞質(zhì)和細胞核中進行YTHDF2的免疫印跡分析。
c. 在Jurkat-shCtrl和Jurkat-shMETTL3細胞中進行YTHDF2與IKZF3相關(guān)PLA分析。
d. 用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時）刺激的Mettl3^F/F或Mettl3^CKO CD8 T細胞中進行YTHDF2與IKZF3相關(guān)PLA分析。
e. 在引入帶有Flag標簽的野生型或突變型YTHDF2的Jurkat細胞中，進行Flag與IKZF3相關(guān)聯(lián)的PLA分析。
f. 在METTL3敲低和對照Jurkat細胞中，有或沒有YTHDF2過表達（OE）的Ki-67 MFI的定量分析（5個獨立樣本）。
g. 在METTL3敲低和對照Jurkat細胞中，有或沒有YTHDF2過表達（OE）的新生RNA合成的Click-it RNA成像分析（5個獨立樣本）。
h. 在naïve或激活的人類T細胞（抗CD3/CD28，5小時）中Ythdf2位點的ATAC-seq軌跡（GSE116696）。
i. 在用或不用抗CD3/CD28（5μg/ml）和ActD（500 μg/ml）刺激24小時的CD8 T細胞中，通過qPCR檢測Ythdf2 mRNA水平（5個獨立樣本）。
j. 在naïve（0小時）或激活（6小時）的WT（5個獨立樣本）和Ythdf2 −249（5個獨立樣本）CD8 T細胞中通過qPCR檢測Ythdf2 mRNA水平。
k. Naïve Ythdf2 −249（3個獨立樣本）和WT（3個獨立樣本）CD8 T細胞用ActD（500μg/ml）處理，并在ActD處理后的不同時間點收集RNA。通過qPCR檢測Ythdf2 mRNA水平，并表示為轉(zhuǎn)錄抑制（TI）后剩余的mRNA。
l. 在naïve（0小時）或激活（24小時）的WT與Ythdf2 −249 CD8 T細胞的細胞質(zhì)和細胞核中進行YTHDF2的免疫印跡分析。
 
（7）YTHDF2在人類腫瘤浸潤性T細胞中的表達和分布。
 

圖7：人類癌癥中YTHDF2的表達和分布與T細胞功能相關(guān)。
 

a. 小提琴圖比較了根據(jù)單細胞RNA測序數(shù)據(jù)得出的高或低多功能性特征分數(shù)的CD8 T細胞中Ythdf2基因表達水平。左圖，CRC（結(jié)直腸癌），n=10名患者。中間，PDAC（胰腺導(dǎo)管腺癌），n=20名患者。右圖，HCC（肝細胞癌），n=31名患者。
b. 小提琴圖比較了治療前后應(yīng)答和不應(yīng)答CD8 T細胞中Ythdf2基因表達水平。左圖，治療前黑色素瘤，n=19（治療前）或29（治療后）。右圖，HCC，n=31（治療后）。
c. 小提琴圖比較了接受新輔助抗PD-1治療的HCC中生成的CD8 T細胞簇中Ythdf2基因表達水平。
d-i. 來自HCC（n=45名患者，d-g）或CRC（n=30名患者，h-k）的經(jīng)治療患者的組織切片被染色為CD8（紅色）、YTHDF2（綠色）和DAPI（藍色）。
d-h. 來自HCC（d）和CRC（h）患者的切片的代表性免疫熒光圖像，顯示對新輔助化療（免疫）治療的不同反應(yīng)。虛線框表示底部單獨通道顯示的4倍放大區(qū)域。白色箭頭指向YTHDF2和CD8陽性細胞。量化CD8 T細胞的數(shù)量（e, i），YTHDF2陽性CD8 T細胞的頻率（f, j）以及CD8 T細胞中YTHDF2的強度（g, k）。CR，完全反應(yīng)；PR，部分反應(yīng)；SD，疾病穩(wěn)定；PD，疾病進展。
 
研究小結(jié)：
本研究通過RIP-seq、RNA-seq、m6A-seq、ATAC-seq等分析揭示了YTHDF2在早期效應(yīng)T細胞和效應(yīng)樣T細胞中選擇性上調(diào)和重新分布；YTHDF2缺失加劇了腫瘤進展，并對小鼠和人類的PD-1阻斷治療無反應(yīng)性；YTHDF2通過m6A依賴性RNA衰變預(yù)防線粒體功能障礙；YTHDF2與IKZF1/3互作促進T細胞多功能性；通過聯(lián)合使用IKZF1/3抑制劑來那度胺，可以恢復(fù)YTHDF2缺失T細胞的免疫治療效果。
本研究結(jié)果表明，YTHDF2通過協(xié)調(diào)表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)來增強T細胞免疫，可能為治療干預(yù)提供信息。YTHDF2表達和分布與人類腫瘤中T細胞功能相關(guān)，可能作為癌癥預(yù)后的臨床指標。
 
研究亮點：

• 揭示了YTHDF2在CD8 T細胞中的新功能，即通過m6A依賴性機制調(diào)控T細胞的抗腫瘤功能。
• 首次展示了YTHDF2在T細胞激活和治療誘導(dǎo)核重新定位。
• 提出了YTHDF2與IKZF1/3互作新機制，這一發(fā)現(xiàn)可能對開發(fā)新的免疫療法具有重要意義。
• 研究結(jié)果強調(diào)了YTHDF2在自然和ICB誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵作用，并可能作為預(yù)測癌癥治療反應(yīng)的生物標志物。

 
參考文獻：
Zhang H, et al. YTHDF2 upregulation and subcellular localization dictate CD8 T cell polyfunctionality in anti-tumor immunity. Nat Commun. 2024 Nov 5;15(1):9559. doi: 10.1038/s41467-024-53997-6.