1、 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織（牛肉、雞肉和豬肉）等樣本中的安定藥物（又名地西泮，Diazepam，DZP），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的安定藥物和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗安定藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含安定藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中安定藥物的殘留量。

2、 技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.3 ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織（牛肉、雞肉和豬肉）…………5ppb
尿樣……………………………………5ppb
配合料…………………………………50ppb
濃縮料/預(yù)混料………………………100ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
地西泮（安定）………………………100%
硝西泮………………………………＜10%
奧沙西泮……………………………＜10%
2.5 樣本回收率：
組織…………………………………90%±20%

3、 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準液：各1ml
0ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb、24.3ppb
高標準液（紅蓋）：1ppm ……………1ml
酶標記物（紅蓋）……………………11ml
抗體工作液（藍蓋）…………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2×復(fù)溶液(黃蓋)………………………50ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個

4、 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：正己烷、NaOH

5、 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：
配液1：復(fù)溶液
將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份復(fù)溶液加1份去離子水）,用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液2：工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
配液3：0.1M 氫氧化鈉
稱取4g NaOH加去離子水混勻溶解，定容至1000ml。

5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本處理方法：
1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g于50ml離心管中，加入8ml 0.1M 氫氧化鈉溶液振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min；
2）取1ml上清液，加入10ml正己烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；
3）取5ml上層正己烷相吹干；
4）取1ml復(fù)溶液溶解殘留物，取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：5ppb
5.3.2 尿液樣本處理方法：
1）取1ml清亮尿樣于50ml離心管中，加入4ml 0.1M 氫氧化鈉溶液振蕩2min；
2）取1ml混合液，加入10ml正己烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；
3）取5ml上層正己烷相吹干；
4）取1ml復(fù)溶液溶解殘留物，取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：5ppb
5.3.3 飼料樣本處理方法：
1）稱取均質(zhì)后的飼料樣本1±0.05g于50ml離心管中，加入1ml去離子水和3ml 0.1M 氫氧化鈉溶液振蕩2min；
2）加入10ml正己烷，振蕩10min，室溫4000r/min以上離心10min；
3）取1ml上層正己烷相吹干；
4）取1ml復(fù)溶液溶解殘留物，再按以下稀釋：
——配合料：將樣本提取液用復(fù)溶液按1:9稀釋后檢測(1份樣本提取液+9份復(fù)溶液)
樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測下限：50ppb
——濃縮料/預(yù)混料：將樣本提取液用復(fù)溶液按1:19稀釋后檢測(1份樣本提取液+19份復(fù)溶液)
樣本稀釋倍數(shù)：200    檢測下限：100ppb

6、 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應(yīng)時間）。
6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7、 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
 
8、 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9、 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。