Fig 1. 成人甲基化圖譜

2. 甲基化的個(gè)體間變異
甲基化模式在不同的個(gè)體中非常穩(wěn)健。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型，0.5%或更少的細(xì)胞塊在不同的供體中顯示出50%或以上的差異，而在不同細(xì)胞類型的樣本中顯示出的差異為4.9%，說(shuō)明了DNA甲基化主要由細(xì)胞譜系和細(xì)胞類型特異性程序決定，而不是由遺傳或環(huán)境因素決定。

3. 甲基化記錄了發(fā)育歷史
雖然DNA甲基化模式反映了細(xì)胞的功能特性，但它們也可以用來(lái)追蹤細(xì)胞的發(fā)育歷史。為了識(shí)別早期祖細(xì)胞的后代共享的模式，作者計(jì)算了至少4個(gè)cpg塊內(nèi)的平均甲基化，并選擇了在所有樣本中顯示變異性最高的塊。然后使用一種無(wú)監(jiān)督的凝聚算法對(duì)所有205個(gè)甲基化組進(jìn)行了聚類，該分析系統(tǒng)地將相同細(xì)胞類型的生物樣本進(jìn)行了分組。這支持了細(xì)胞分離的可重復(fù)性，并表明每種正常細(xì)胞類型的三到四次重復(fù)足以推斷其甲基化模式，用于實(shí)際應(yīng)用，如生物標(biāo)志物識(shí)別。該算法沒(méi)有對(duì)相關(guān)的細(xì)胞類型進(jìn)行分組，而且通常根據(jù)供體身份對(duì)樣本進(jìn)行聚類。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了仔細(xì)純化均質(zhì)細(xì)胞類型的重要性，避免了混合細(xì)胞群。
 

Fig 2. 無(wú)監(jiān)督的聚集聚類反映了人類健康細(xì)胞類型的發(fā)育譜系

4. 細(xì)胞類型特異性的甲基化標(biāo)記物
將205個(gè)樣本組織成39組特定的細(xì)胞類型，包括血細(xì)胞類型、乳腺上皮、肺上皮、胰腺內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞、不同來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞等。重點(diǎn)關(guān)注由5個(gè)或更多cpg組成的差異甲基化塊，這些cpg在一組細(xì)胞類型中未被甲基化，但在所有其他樣本中均被甲基化，反之亦然。幾乎所有區(qū)域（97%）在一種細(xì)胞類型中都未被甲基化，而在其他所有其他細(xì)胞類型中都被甲基化。然后根據(jù)靶細(xì)胞類型與所有其他樣本的甲基化的絕對(duì)差異對(duì)這些差異區(qū)域進(jìn)行了分類。

每種細(xì)胞類型的前25個(gè)差異未甲基化區(qū)域包含了一個(gè)由1246個(gè)標(biāo)記組成的人類細(xì)胞類型特異性甲基化圖譜。這些區(qū)域在特定的細(xì)胞類型中是獨(dú)特的未甲基化的（平均甲基化13%），在所有其他樣本中是甲基化的（平均甲基化91%），并且可以作為敏感的生物標(biāo)志物，用于定量來(lái)自混合物中特定細(xì)胞類型的DNA的存在。這些標(biāo)記物包括953個(gè)細(xì)胞類型特異性的未甲基化的位點(diǎn)，以及另外293個(gè)未甲基化的位點(diǎn)在少數(shù)相關(guān)的細(xì)胞類型中。
 

Fig 3. 39種細(xì)胞類型的205個(gè)樣本的人類甲基化圖譜

5. 人類細(xì)胞類型特異性調(diào)控圖譜
作者分析了通過(guò)測(cè)序（ATAC-seq）、DNase I超敏位點(diǎn)測(cè)序（DNaseI-seq）和組蛋白修飾特異性標(biāo)記的DNA可及性和染色質(zhì)狀態(tài)。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的前250個(gè)未甲基化標(biāo)記物高度可及，在單核細(xì)胞中有H3K27ac和H3K4me1，而其他細(xì)胞類型的標(biāo)記物在單核細(xì)胞中沒(méi)有富集，其他細(xì)胞類型的標(biāo)記物也有類似的結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)了chromHMM增強(qiáng)子注釋在細(xì)胞類型特異性標(biāo)記上富集。這些發(fā)現(xiàn)與之前的研究一致，即組織特異性去甲基化與基因增強(qiáng)子有關(guān)。

為了進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞類型特異性未甲基化區(qū)域的生物學(xué)重要性，作者研究了它們與轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的關(guān)聯(lián)，這些轉(zhuǎn)錄因子可能影響DNA甲基化，也可能以細(xì)胞類型特異性的方式結(jié)合DNA，這取決于甲基化和染色質(zhì)。作者鑒定了每個(gè)細(xì)胞類型的前1000個(gè)未甲基化標(biāo)記物，并使用HOMER39進(jìn)行了基序分析，從而計(jì)算已知TF結(jié)合基序的富集情況。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型，頂部基序包括主調(diào)節(jié)因子和關(guān)鍵TFs。這種細(xì)胞類型特異性的未甲基化區(qū)域和TF結(jié)合基序之間的關(guān)聯(lián)可以識(shí)別新的基因調(diào)控回路，并暴露在特定細(xì)胞類型中活躍的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子。這突出了許多細(xì)胞類型的標(biāo)志性基因，并提出了每種細(xì)胞類型的前25個(gè)未甲基化標(biāo)記的假定靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了這樣一個(gè)原則，即特定細(xì)胞類型中未甲基化的位點(diǎn)可能是增強(qiáng)子，正向調(diào)節(jié)該細(xì)胞類型中表達(dá)的基因，通�？刂凄徑�基因。然而，在特定的細(xì)胞類型中，與特定未甲基化的位點(diǎn)相鄰的基因通常廣泛表達(dá)于這種細(xì)胞類型之外。

為了生成每種細(xì)胞類型中假定的調(diào)節(jié)區(qū)域的目錄，對(duì)每種細(xì)胞類型的所有樣本進(jìn)行了片段水平分析，獨(dú)立于其他細(xì)胞類型。掃描了整個(gè)基因組，并確定了至少85%具有至少4個(gè)cpg的DNA片段未甲基化的基因組區(qū)域。這在分析的39個(gè)細(xì)胞類型組中確定了一組未甲基化的基因組區(qū)域，其中平均包括36111個(gè)區(qū)域。然后對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行了基因組特征注釋，結(jié)果顯示，平均56%的CpG島重疊，46%位于啟動(dòng)子區(qū)域附近，44%的CTCF結(jié)合位點(diǎn)重疊，從而突出了未甲基化位點(diǎn)的調(diào)控和結(jié)構(gòu)作用。
 

Fig 4. 細(xì)胞類型特異性標(biāo)記作為假定的增強(qiáng)因子

6. 細(xì)胞類型特異性的高甲基化位點(diǎn)
作者研究了那些在一種細(xì)胞類型中甲基化但在人體其他地方未甲基化的基因組區(qū)域。這些區(qū)域富集于CpG島（38%的甲基化區(qū)域，而細(xì)胞類型特異性的未甲基化區(qū)域?yàn)?.7-2.7%），并在其他細(xì)胞類型中被H3K27me3和Polycomb標(biāo)記。這些細(xì)胞類型特異性的高甲基化區(qū)域通常對(duì)基序富集不那么顯著，只有大約3%的細(xì)胞類型特異性差異甲基化區(qū)域被高甲基化。

在匯集了所有細(xì)胞類型特異性的高甲基化區(qū)域后，發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子CTCF的目標(biāo)序列的強(qiáng)富集。這表明CTCF結(jié)合位點(diǎn)的DNA甲基化可能作為一個(gè)組織特異性的調(diào)控開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)節(jié)其結(jié)合，并可能影響組織特異性。為了驗(yàn)證這一想法，作者比較了CTCF位點(diǎn)的DNA甲基化模式與特定組織中全基因組CTCF蛋白結(jié)合模式。特定細(xì)胞類型中甲基化的位點(diǎn)被富集為神經(jīng)基因轉(zhuǎn)錄抑制因子re1沉默TF/神經(jīng)元限制性沉默因子（REST/ NRSF）的靶點(diǎn)（P≤1×10-24），這在胰島細(xì)胞的甲基化組中最為顯著。雖然DNA甲基化尚未被證明會(huì)影響REST的結(jié)合或活性，但這一發(fā)現(xiàn)提出了一種可能性，即胰島中REST靶點(diǎn)的甲基化可以允許獨(dú)立于REST抑制的內(nèi)分泌分化。
 

Fig 5. CpG島、Polycomb靶點(diǎn)、CTCF和REST/NSRF的細(xì)胞類型特異性高甲基化區(qū)域豐富

7. 片段級(jí)的甲基化組反褶積
作者開(kāi)發(fā)了一種用于DNA甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)的計(jì)算片段級(jí)反褶積算法，并使用每種細(xì)胞類型定義的前25個(gè)標(biāo)記（共1246個(gè)標(biāo)記）來(lái)研究從復(fù)合組織樣本和cfDNA中獲得的甲基組。

對(duì)于每一種細(xì)胞類型，作者采用留一的方法在白細(xì)胞讀取中混合一個(gè)保留的樣本，然后使用反褶積算法來(lái)推斷混合物中的細(xì)胞組成。在濃度從0到10%不同的情況下重復(fù)了這個(gè)過(guò)程。如圖6a所示，發(fā)現(xiàn)1246個(gè)標(biāo)記（每個(gè)細(xì)胞類型的前25個(gè)）可以在大約0.1%的分辨率下準(zhǔn)確檢測(cè)來(lái)自給定來(lái)源的DNA，與基于陣列的方法相比，提高了近一個(gè)數(shù)量級(jí)。

利用來(lái)自23名健康捐贈(zèng)者的WGBS數(shù)據(jù)估計(jì)了白細(xì)胞和cfDNA的細(xì)胞組成；99.5%的白細(xì)胞來(lái)源的DNA屬于粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK、T和B細(xì)胞，與典型的血細(xì)胞計(jì)數(shù)一致。健康受試者的cfDNA主要來(lái)源于白細(xì)胞：粒細(xì)胞（29.7%）、單核/巨噬細(xì)胞（20%）和淋巴細(xì)胞（3%）。有助于cfDNA的實(shí)體組織包括血管內(nèi)皮細(xì)胞（6%）和肝細(xì)胞（3.1%），與之前的結(jié)
果一致。
 

Fig 6. 使用細(xì)胞類型特異性生物標(biāo)志物的片段級(jí)反褶積

參考文獻(xiàn)：
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