前列腺癌患者在接受雄激素受體信號抑制劑（ARSI）治療后，可能會出現(xiàn)耐藥性，導致治療誘導的神經(jīng)內(nèi)分泌樣前列腺癌（therapy-induced neuroendocrine-like prostate cancer,t-NEPC）發(fā)生。t-NEPC是一種高侵襲性亞型，具有小細胞樣特征，對紫杉醇化療具有耐藥性，且總體生存率較差。t-NEPC的適應性神經(jīng)特征是否是導致這種紫杉醇耐藥性的原因尚不清楚。
 
2024年8月25日，美國內(nèi)布拉斯加大學M. Jordan Rowley & Samikshan Dutta團隊合作試圖揭示t-NEPC的神經(jīng)適應性特征是否與紫杉醇耐藥性有關。研究團隊通過分析患者基因表達數(shù)據(jù)庫，并通過ATAC-Seq、乙�；�組蛋白ChIP-seq和RNA-seq等測序分析，探討了Pax5作為轉(zhuǎn)錄因子在t-NEPC中的作用，以及其在神經(jīng)內(nèi)分泌樣特征基因表達中的重要性。相關研究成果以“Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers”為題發(fā)表在Nature出版集團旗下刊物《Cell Death & Disease》上。
 

標題：Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers（Pax5在多西紫杉醇耐藥性神經(jīng)內(nèi)分泌樣前列腺癌發(fā)展中的作用）
發(fā)表期刊：Cell Death & Disease
影響因子：8.1 / 1區(qū)
技術平臺：ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq等
 
本研究旨在理解Pax5在多西紫杉醇（多西他賽，docetaxel）耐藥性神經(jīng)內(nèi)分泌樣前列腺癌（t-NEPC）發(fā)展中的作用。首先，研究通過對患者基因表達數(shù)據(jù)庫的通路分析表明，t-NEPC上調(diào)與增強細胞網(wǎng)絡相關的多種神經(jīng)通路。為鑒定可能對促進t-NEPC中神經(jīng)特征基因表達重要的轉(zhuǎn)錄因子（TF），研究在NE樣細胞系模型中進行了ATAC-Seq、乙酰化組蛋白ChIP-seq和RNA-seq測序，并分析了轉(zhuǎn)錄活躍且顯著富集的神經(jīng)內(nèi)分泌樣（NE樣）癌特異性基因的啟動子。分析結果表明，Pax5可能是一個對神經(jīng)基因表達重要的轉(zhuǎn)錄因子，且在t-NEPC中具有特異性。通路分析揭示Pax5表達參與軸突導向、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控和神經(jīng)粘附，這些對強大的細胞通訊至關重要。進一步結果表明，Pax5耗竭破壞了NE樣細胞中神經(jīng)突介導的細胞通訊，并減少表面生長因子受體激活，從而提高對多西紫杉醇治療的敏感性。t-NEPC特異性Pax5啟動子CpG島的羥甲基化有利于Pbx1結合，從而誘導Pax5表達�；�于此研究可以得出結論，持續(xù)暴露于ARSI療法會導致t-NEPC中Pax5激活的表觀遺傳修飾，促進采用耐紫杉醇NE樣癌癥所需的基因表達。因此，靶向Pax5軸可能有助于恢復其紫杉醇敏感性。
 
研究方法：

• 利用公開的患者RNA-Seq數(shù)據(jù)進行分析。
• 在NE樣細胞系模型中進行ATAC-Seq、乙酰化組蛋白ChIP-seq和RNA-seq。
• 通過轉(zhuǎn)錄因子結合位點分析、基因集富集分析（GSEA）和基因本體（GO）分析等生物信息學方法進行數(shù)據(jù)解析。
• 通過實驗操作，如siRNA干擾、過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等，研究Pax5在細胞中的功能。

 
結果圖形
（1）NE樣轉(zhuǎn)化適應特異性基因特征

圖1：神經(jīng)內(nèi)分泌分化攜帶神經(jīng)元特征。

A. C4-2BER細胞與C4-2B細胞之間的RNA表達差異。
B. 對腺癌（C4-2B和C4-2，每組三個重復）和神經(jīng)內(nèi)分泌樣（NE樣）細胞（C4-2BER和DKD，每組三個重復）之間的基因表達進行比較研究。I型基因集代表由REST抑制因子調(diào)控的基因，II型表示參與神經(jīng)內(nèi)分泌途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。所有這些細胞系的RNA表達分析在RNA-seq之后進行。
C. 在類似的腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞系中對雄激素受體（AR）調(diào)控的基因進行比較分析。
D. 維恩圖表示兩種不同的神經(jīng)內(nèi)分泌樣細胞系中共同差異表達的基因。
E. 使用共有差異富集的基因集，使用gProfiler進行通路分析。BP代表生物學通路，MF代表分子通路。散點圖表示與神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化相關的差異化富集通路。
 
（2）染色質(zhì)可及性和組蛋白乙�；�增加，在NE樣轉(zhuǎn)化過程中誘導轉(zhuǎn)錄激活
 

圖2：神經(jīng)內(nèi)分泌分化中的染色質(zhì)可及性差異。

A. 熱圖顯示C4-2B和C4-2BER中差異上調(diào)基因的ATAC-Seq信號比較。
B. 熱圖顯示C4-2B和C4-2BER中差異下調(diào)基因的ATAC-Seq信號比較。
C. IGV瀏覽器顯示C4-2B和C4-2BER中Hox A基因位點的差異ATAC seq信號。
D. 免疫印跡顯示C4-2B和C4-2BER中H3K9、H3K18和H3K27組蛋白乙�；�水平。
E. 熱圖顯示C4-2B和C4-2BER中差異活躍位點H3K27ac和H3K18ac的ChIP-Seq信號比較。
F. 維恩圖顯示C4-2BER ATAC-seq峰值上發(fā)生的差異化ChIP-Seq（H3K18ac和H3K27ac）峰值重疊。
G. 圖2F的差異活躍染色質(zhì)位點附近的基因的RNA-seq表達水平（TPM）。
 
（3）神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化后Pax5表達增加

圖3：新可接近啟動子附近的轉(zhuǎn)錄因子結合差異。

 A. 熱圖顯示A. C4-2B和C4-2BER細胞（N=3）中的轉(zhuǎn)錄因子表達。
 B.  C4-2和DKD細胞（N=3）。
C-D.  RT-PCR顯示C4-2與DKD以及C4-2B與C4-2BER細胞中Pax5、ETV5、FOXC1、ETS2、KLF12、ELF3的相對基因表達。
E. 圖像顯示與由TOMTOM確定的Pax5 motif相比，在差異活躍位點識別的motif。

圖4：Pax5在不同細胞類型中的表達。

A. 免疫印跡圖顯示C4-2、C4-2B、C4-2BER、DKD和NCI-H660中Pax5的比較表達，HSC70為對照。（n=3）。
B. RT-PCR顯示C4-2B和C4-2BAR細胞中Pax5的RNA表達。
C. 從小鼠細胞系中耗竭RB1后Pax5表達。
D. 在LuCaP TMA中對Pax5進行染色。代表性的IHC染色顯示了Pax5在腺癌、CRPC和NE樣癌癥中的表達。
E. 在轉(zhuǎn)移性前列腺TMA中對Pax5進行染色。圖中顯示IHC檢測的Pax5表達。
 
（4）Pax5 參與神經(jīng)元通路相關基因表達譜
 

圖5：Pax5在NE樣細胞中調(diào)控多種與神經(jīng)相關通路。

A. 在Pax5耗竭后，C4-2BER和DKD中Pax5調(diào)控的重要神經(jīng)通路基因表達熱圖。
B. 使用在Pax5耗竭后NE樣細胞中差異調(diào)控的Pax5基因進行GSEA通路分析。
C-D. 在NE樣細胞C4-2BER和DKD中，通過siRNA短暫耗竭Pax5后，驗證Pax5調(diào)控的基因集。
E-F.  在NE樣細胞（DKD）中，通過多西環(huán)素誘導的兩個獨立shRNA短暫耗竭Pax5后，驗證Pax5調(diào)控的基因集。
G.  ChIP-qPCR顯示與陰性對照PGM5（兩組引物P1和P2）和IgG相比，Pax5調(diào)控基因富集情況。
 
（5）Pax5耗竭增強了多西他賽在t-NEPC中的治療效果。
 

圖6：Pax5耗竭影響細胞通訊并增強治療效果。

A-E. 免疫熒光圖像顯示在Pax5耗竭后，DKD和C4-2BER細胞表面NCAM1表達情況，耗竭方法包括siRNA或shRNA（多西環(huán)素誘導，shRNA表達以紅色熒光顯示）或在Pax5敲低細胞中異位表達Pax5。
F.  超級圖表代表在Pax5耗竭和Pax5過表達下，C4-2BER和DKD中類神經(jīng)突數(shù)量的定量分析。
G. 在DKD中，在對照和Pax5耗竭條件下，免疫印跡顯示生物素拉下樣本中NCAM1表達。也顯示了對照和Pax5耗竭下的總蛋白。
H-K.  在有或沒有Pax5情況下，通過丙碘銨染色在DKD和C4-2BER細胞中分別定量化療應激下的細胞活力。
L-M.  免疫熒光圖像顯示在DKD和C4-2BER細胞中有或沒有Pax5情況下，磷脂酰肌醇激酶（p-AKT S-473）表面染色（DKD為品紅色，C4-2BER為綠色）；條形圖顯示定量。
N. 在DKD中，在對照和Pax5敲低條件下，免疫印跡顯示p-AKT 473和總AKT的表達。
O. 在DKD中，在對照和Pax5敲低條件下，免疫印跡顯示p-EGFR與總EGFR的表達。
 
（6）Pbx1調(diào)控NE樣前列腺癌中Pax5表達
 

圖7：Pbx1調(diào)控Pax5。

A. C4-2B和C4-2BER細胞中Pax5啟動子附近的ATAC-seq和H3K18/H3K27乙�；疌hIP-seq信號。
B. DKD與C4-2以及C4-2BER與C4-2B中Pbx1的表達。
C. 腺癌和NE樣細胞中Pbx1表達的免疫印跡。
D-E.  在DKD和C4-2BER細胞中Pbx1耗竭后Pax5表達的RT-PCR分析。
F.   C4-2BER細胞中Pbx1耗竭后Pax5表達的免疫印跡。
G.  使用設計在Pax5啟動子上游的引物進行Pbx1 ChIP-qPCR。
H.  DKD和C4-2細胞中Pax5基因的Epic甲基化芯片分析示意圖。綠色三角形代表位于CpG島的區(qū)域。放大了兩細胞系近端啟動子的胞嘧啶甲基化狀態(tài)，并顯示了每個區(qū)域的甲基化狀態(tài)。紅色代表甲基化/修飾的胞嘧啶，綠色是去甲基化胞嘧啶。Pbx1在啟動子結合位點由箭頭表示。
I.  各種前列腺癌細胞系中TET2表達的免疫印跡。
J.  Pbx1結合位點的Pax5啟動子區(qū)域通過ChIP-qPCR分析了5hmC足跡標記。
K.  DKD細胞用Bobcat339（50μM，18-24小時）處理后進行5hmC和Pbx1 ChIP-qPCR，并與未處理的對照樣本比較。
L.  對DKD細胞用5-Azacytidine（0.1μM，5-7天）和Bobcat339處理后，進行RT-PCR分析Pax5基因表達。
M. 在t-NEPC維持中Pbx1/Pax5調(diào)控的整體示意圖。

參考文獻：
Bhattacharya S, Harris HL, Islam R, Bodas S, Polavaram N, Mishra J, Das D, Seshacharyulu P, Kalluchi A, Pal A, Kohli M, Lele SM, Muders M, Batra SK, Ghosh PM, Datta K, Rowley MJ, Dutta S. Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers. Cell Death Dis. 2024 Aug 25;15(8):617. pii: 10.1038/s41419-024-06916-y. doi: 10.1038/s41419-024-06916-y. PubMed PMID: 39183332.