編者按

在單細(xì)胞空間多組學(xué)時(shí)代，盡管新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序仍然是揭示復(fù)雜疾病分子機(jī)制的強(qiáng)大工具，是找尋疾病靶點(diǎn)的關(guān)鍵手段之一。本文將介紹一篇今年發(fā)表的關(guān)于原發(fā)性膽汁性膽管炎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究文獻(xiàn)，通過詳細(xì)解析該研究的設(shè)計(jì)思路和方法，帶大家領(lǐng)略如何利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)表高分文獻(xiàn)。

研究背景

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）是一種以多系免疫失調(diào)為特征的慢性自身免疫性肝病，可導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化甚至肝硬化。由于傳統(tǒng)檢測方法的局限性，PBC的局部肝臟免疫發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

文章詳情

文章題目：Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis
中文題目：單細(xì)胞RNA測序揭示肝臟駐留Th1樣細(xì)胞在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的促炎作用
發(fā)表時(shí)間：2024.10
期刊名稱：Nature Communications
影響因子：14.7
實(shí)驗(yàn)平臺：10X Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
DOI：10.1038/s41467-024-53104-9

技術(shù)路線

為了方便各位老師快速掌握研究思路，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞：

研究結(jié)果

1.PBC患者肝臟和PBMC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了闡明PBC患者的浸潤型免疫細(xì)胞特性，對5名未接受熊去氧膽酸（UDCA）治療且處于Nakanuma分期I~II期的PBC患者、5名肝血管瘤患者（肝臟健康對照組）以及5名健康供者（PBMC健康對照組）的肝臟組織和外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和細(xì)胞注釋。與對照組相比，PBC中免疫細(xì)胞亞群分布的變化在肝臟和PBMC之間并未表現(xiàn)出一致的模式。細(xì)胞因子評分和炎癥評分結(jié)果表明，PBC患者的肝臟顯示出增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，而在外周血中則沒有這種現(xiàn)象。因此，我們將研究重點(diǎn)放在探索PBC中肝細(xì)胞的病理特征上。

Fig.1 PBC 患者肝臟和 PBMC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

2.膽管細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞在PBC中表現(xiàn)出炎癥和基質(zhì)重塑基因表達(dá)增加

對肝臟中的非免疫細(xì)胞重新聚類，發(fā)現(xiàn)了一簇主要來源于PBC組的活化星狀細(xì)胞，可能在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑并最終導(dǎo)致PBC肝纖維化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在PBC患者的膽管細(xì)胞中，與膽管細(xì)胞生理功能相關(guān)的多個(gè)通路下調(diào)，炎癥相關(guān)基因及通路上調(diào)和激活，暗示膽管細(xì)胞可能進(jìn)入衰老狀態(tài)并參與了膽管的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞通訊分析和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在炎癥微環(huán)境中，高表達(dá)CCR7的初始T細(xì)胞和B細(xì)胞可能被星狀細(xì)胞直接招募到局部炎癥區(qū)域，并分別分化為輔助T細(xì)胞和漿細(xì)胞。衰老的膽管細(xì)胞和活化的星狀細(xì)胞在放大炎癥信號和促進(jìn)PBC肝纖維化的過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。

Fig.2 PBC患者肝臟非免疫細(xì)胞的特點(diǎn)

3. PBC肝臟的庫普弗細(xì)胞清除功能降低，炎癥功能增強(qiáng)

在髓系細(xì)胞中，CD14+單核細(xì)胞的比例減少，而肝臟駐留的庫普弗細(xì)胞比例增加。盡管PBC患者肝臟中的單核細(xì)胞數(shù)量減少，但庫普弗細(xì)胞的細(xì)胞因子評分以及促炎基因如IL1B和CXCL2的表達(dá)卻增加，同時(shí)TNF也顯示出上升趨勢。庫普弗細(xì)胞中清道夫功能相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，說明庫普弗細(xì)胞增強(qiáng)的促炎作用可能加劇肝臟局部的炎癥反應(yīng)，而其清道夫功能的抑制可能減緩衰老膽管細(xì)胞和活化星狀細(xì)胞的清除過程。

Fig.3 PBC患者肝髓系細(xì)胞的特征

4. PBC患者肝內(nèi)T細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的促炎功能和降低的細(xì)胞毒性

PBC組中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）比例增加，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，促免疫與抑制免疫的功能基因均被激活，說明PBC患者的Treg細(xì)胞處于異常激活狀態(tài)。具有強(qiáng)烈促炎特性的Th1樣細(xì)胞比例顯著增加，CX3CR1+CD8+T細(xì)胞和CX3CR1+NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能受到抑制。細(xì)胞毒性功能受損可能會阻礙衰老膽管細(xì)胞和活化星狀細(xì)胞的清除，從而加劇疾病的發(fā)展。細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)典樹突狀細(xì)胞（cDCs）可能通過激活Th1樣細(xì)胞而在PBC的發(fā)展中扮演不可或缺的角色�？傮w而言，Th1樣細(xì)胞在PBC中發(fā)揮了主導(dǎo)性的促炎作用。

Fig.4 PBC 患者肝臟T細(xì)胞的特征

5. 促炎性Th1樣細(xì)胞僅限于肝臟組織，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)

Th1樣細(xì)胞表達(dá)了與組織駐留相關(guān)的基因，而幾乎不表達(dá)與T細(xì)胞歸巢相關(guān)的基因，表明其具有組織駐留特征。對PBC患者肝臟進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，組織駐留的Th1樣細(xì)胞參與了PBC的發(fā)展，并促進(jìn)了肝組織的炎癥和纖維化進(jìn)程。轉(zhuǎn)錄因子分析（SCENIC）發(fā)現(xiàn)在Th1樣細(xì)胞中最特異性激活的轉(zhuǎn)錄因子在PBC組中進(jìn)一步增強(qiáng)，包括RUNX1和STAT1，這表明RUNX1和STAT1的激活可能在Th1樣細(xì)胞效應(yīng)功能中發(fā)揮重要作用。

Fig.5 PBC患者肝臟駐留Th1樣細(xì)胞的特征

6. 促炎性Th1樣細(xì)胞在PBC小鼠肝臟中擴(kuò)增

用2-辛.炔酸與牛血清白蛋白（2OA-BSA）偶聯(lián)物免疫的PBC小鼠會出現(xiàn)典型的門靜脈CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤表型。對這種模型和對照小鼠肝臟組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)模型組中髓系細(xì)胞和T細(xì)胞的比例增加，而非免疫細(xì)胞如膽管細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例減少，并且膽管細(xì)胞和星狀細(xì)胞可能被TNF、IL1B和IFNG等促炎因子激活，并產(chǎn)生多種趨化因子以招募免疫細(xì)胞來放大炎癥信號。高表達(dá)Ifng的Th1樣細(xì)胞群體有增加的趨勢，并具有組織駐留特性，與人肝臟中的Th1樣細(xì)胞有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)具有組織駐留表面分子特征的CD4+T細(xì)胞在疾病模型小鼠的肝臟中擴(kuò)增。這些細(xì)胞通過分泌IFNγ表現(xiàn)出獨(dú)特的Th1樣特性和促炎能力，并參與了膽管炎發(fā)展，可能與先前報(bào)道的組織駐留記憶T細(xì)胞有所重疊。

Fig.6 PBC小鼠肝臟中Th1樣細(xì)胞的鑒定和特征

7. 阻斷JAK/STAT通路可減輕PBC小鼠的膽管損傷并改善肝臟駐留的Th1樣細(xì)胞

研究者發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路可能參與疾病發(fā)展，因此假設(shè)巴瑞替尼（一種已被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的JAK1/JAK2抑制劑）可能阻斷由Th1樣細(xì)胞引起的免疫紊亂。對PBC小鼠治療2周后發(fā)現(xiàn)，門靜脈區(qū)域的炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，膽管細(xì)胞壞死也有所緩解。該藥物顯著抑制了T細(xì)胞的擴(kuò)張，局部IFNγ和TNFα蛋白水平也顯著降低。與未治療組比較T細(xì)胞比例差異發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)炎癥的緩解與IFNγ分泌的Th1樣細(xì)胞數(shù)量減少相關(guān)，這種治療效果更可能是由CD69+肝駐留細(xì)胞群提供的。這些結(jié)果表明，巴瑞替尼能夠緩解由2OA-BSA免疫的小鼠膽管炎模型中的癥狀。

Fig.7 巴瑞替尼對PBC小鼠膽管炎的影響

主要結(jié)論

本研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)解析了PBC患者的分子機(jī)制，揭示了膽管細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞參與了肝臟炎癥和纖維化的過程。此外，庫普弗細(xì)胞顯示出促炎因子水平的增加和吞噬功能相關(guān)基因表達(dá)的減少，而T細(xì)胞則表現(xiàn)出促炎因子水平的增強(qiáng)以及細(xì)胞毒性相關(guān)基因表達(dá)的降低。有趣的是，在PBC患者和PBC小鼠模型的肝臟中識別出一個(gè)具有JAK-STAT激活的肝臟駐留Th1樣細(xì)胞群體。阻斷JAK-STAT通路可以緩解肝臟炎癥并在PBC小鼠模型中消除肝臟駐留的Th1樣細(xì)胞。這些結(jié)果擴(kuò)展了對PBC病理機(jī)制的理解，并為PBC患者的治療提供了潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Jin, Ciliang et al. “Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis.” Nature communications vol. 15,1 8690. 7 Oct. 2024.