多光子顯微技術的介紹及其在腦成像中的應用及進展
腦科學研究是生物醫(yī)學領域的重要研究方向，直接的腦顯微成像是研究大腦結構及功能的有效手段。多光子顯微成像信噪比高、成像深度大、光漂白與光毒性小，近年來發(fā)展迅速，被廣泛應用于腦成像研究中。
南京理工大學電子工程與光電技術學院的薛璐團隊發(fā)表文章，描述了多光子顯微成像技術的原理及系統(tǒng)組成，總結了近年來腦成像應用中，多光子顯微成像在成像速度、成像深度及系統(tǒng)小型化三個方面的進展，并展望了其未來發(fā)展前景。
研究背景
腦科學作為極具發(fā)展前景的領域之一，開展基礎腦功能及腦部疾病的研究對人工智能、教育及醫(yī)療等諸多領域的發(fā)展具有深遠意義。大腦是人體最為復雜和神秘的器官，深入理解其結構與功能的運作機制，是解鎖眾多科學與技術難題的關鍵。
目前，計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射計算機斷層掃描（PET）、功能性磁共振成像（FMRI）等技術在基礎研究及臨床醫(yī)療中廣泛應用于大腦結構及功能成像。然而，這些方法的空間分辨率處于厘米量級，僅能確定較為粗糙的結構及功能改變，難以滿足對大腦微觀世界深入探索的需求。
與之相比，光學顯微方法中的多光子成像技術（Multiphoton Microscopy，MPM）脫穎而出。它具備亞細胞分辨率以及三維和深度成像能力，并且光漂白和光毒性小。多光子顯微鏡能夠對完整大腦中的神經膠質細胞、血管結構、神經元回路、樹突棘以及亞細胞成分等進行高空間分辨率成像，為研究大腦生理過程以及阿爾茨海默病、腦卒中、腦腫瘤等典型腦部疾病提供了強有力的工具。
隨著腦科學研究的不斷深入，對腦成像技術提出了更高的要求。在成像深度方面，需要能夠對皮層下方如海馬體、丘腦、下丘腦等更深處的腦區(qū)進行成像；成像速度上，要足夠快以記錄神經元的快速活動；裝置靈活性方面，期望有更小的成像裝置以便對運動的樣本進行靈活成像。這些需求促使研究人員對多光子顯微鏡不斷進行創(chuàng)新與改進，以提升其性能。
多光子成像技術簡介
一、原理
多光子顯微鏡的成像原理基于超短脈沖激光與樣品相互作用時產生的非線性光學效應，主要包括激發(fā)熒光和諧波產生。
雙光子熒光顯微術（two-photon excited fluorescence microscopy，2PEF）和三光子熒光顯微術（three-photon excited fluorescence microscopy，3PEF）利用多光子同時被熒光物質吸收，使其躍遷到高能級，經過振動態(tài)的無輻射躍遷后輻射出熒光光子。其中，2PEF輻射出的熒光光子頻率略小于激發(fā)光頻率的2倍，3PEF輻射出的熒光光子頻率略小于激發(fā)光頻率的3倍。這種成像方式通過收集輻射光子信號來構建圖像。
多光子激發(fā)熒光的信號來源廣泛，可來自外源探針、熒光蛋白或內源性組織分子。內源性組織分子產生的多光子自熒光已被用于識別和定量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、色氨酸等代謝分子，但存在可監(jiān)測分子種類有限和內源信號強度弱的局限性。為增強信號，大量抗體和熒光標記物被開發(fā)用于標記感興趣的組織成分，如Ca²⁺指示劑、遺傳編碼的電壓指示劑等。
2、諧波成像（SHG和THG）
二次諧波（second harmonic generation，SHG）和三次諧波（third harmonic generation，THG）成像利用處于基態(tài)的分子在吸收多個光子后到達虛擬能級，然后直接輻射出高頻光子的原理。SHG輻射出的光子頻率是入射光子頻率的2倍，THG輻射出的光子頻率是入射光子頻率的3倍。諧波信號的產生與樣本材料的非線性極化率相關，反映了樣本材料的微觀特性，如電子態(tài)、分子的對稱性、旋向及排列等。
SHG通常發(fā)生在具有非中心對稱性的化學結構中，如膠原蛋白、肌球蛋白、微管、絲、淀粉和纖維素等；THG則常用于高折射率物質或兩種折射率均勻材料的界面成像，如細胞膜、脂滴、彈性蛋白纖維、鈣化骨和膠原束或肌肉纖維等。
3、多光子成像技術的特點
多光子成像技術在對同一種熒光物質成像時，使用的激發(fā)波長比單光子長，波長越長的激發(fā)光在生物組織中穿透能力越強，有效解決了生物組織中深層物質的成像問題。
多光子激發(fā)是一個非線性過程，只有在激發(fā)光焦點附近的有限區(qū)域才能達到產生熒光所需的激光照射功率密度，非焦點區(qū)域不會產生熒光，減少了焦點外的光漂白和光毒性，適合活體的長時間成像。
多光子成像通過對焦點的三維移動即可獲得樣品的三維顯微圖像，具有天然的光學層析和三維成像能力，在腦成像領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。
二、典型光路
典型多光子顯微鏡主要由以下幾個關鍵部分組成：
1、激光光源
多光子顯微鏡需要高時空相干性的超短脈沖激光來提高多光子效率，與傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡采用的連續(xù)激光不同。鎖模摻鈦藍寶石（Ti:Sapphire）激光器和光纖飛秒激光器是常用的光源，結合光參量振蕩器（Optical Parametric Oscillator，OPO）或光參量放大器（optical parametric amplifiers，OCA）可獲得波長更長的激光，通過改變相位匹配條件還能實現(xiàn)多波長寬帶可調諧輸出。不同成像場景對激光源的物理參數(shù)，如平均功率、脈沖持續(xù)時間、重復頻率、激發(fā)波長和光譜帶寬等有不同要求。
2、光學掃描模塊
掃描模塊對系統(tǒng)成像速度影響較大，目前多數(shù)多光子顯微鏡使用振鏡進行2D掃描，同時共振掃描儀和一些非機械掃描機制的出現(xiàn)進一步提高了成像速度。
3、低倍率高數(shù)值孔徑物鏡
物鏡從全視場收集信號，其數(shù)值孔徑越大，收集到的光越多，分辨率越高。多光子顯微鏡通常配備高數(shù)值孔徑物鏡，并且要求物鏡在近紅外光波段具有高透過率，以減小激發(fā)光的損耗。在對高光散射樣品成像時，低倍率高數(shù)值孔徑物鏡與高靈敏度、低噪聲GaAsP光電倍增管配合使用可提高檢測效率和圖像信噪比。
4、二向色鏡和光電探測器
激光源發(fā)出的光束經掃描器掃描后，通過二向色鏡及物鏡聚焦在樣品上，激發(fā)樣品產生熒光信號和諧波信號，這些信號被物鏡收集并沿原光路返回，二向色鏡將多光子激發(fā)的信號從激發(fā)光中分離出來，引導至光電探測器。通常多光子激發(fā)熒光成像和諧波成像可在同一裝置上實現(xiàn)，通過在探測器前設置濾波片可在光譜上分離不同信號。
多光子腦成像成像深度進展
一、長波長激發(fā)
1、激發(fā)光和發(fā)射光衰減對成像深度的影響
在多光子腦成像中，激發(fā)光和發(fā)射光在生物組織中的衰減嚴重制約了成像深度。增加激光源脈沖能量雖能增強激發(fā)光穿透深度，但會帶來諸多弊端，如提高激光系統(tǒng)成本和復雜性、誘發(fā)多光子電離和光損傷，以及導致失焦和近表面熒光激發(fā)等問題。
采用波長更長的激發(fā)光進行成像可顯著減少組織散射和吸收，避免高能脈沖帶來的問題，是提高成像深度的有效方法。目前多光子顯微鏡常采用Ti:Sapphire激光器產生的700-1100nm飛秒脈沖激發(fā)，為提升成像深度，研究人員開發(fā)了1300nm窗口（由光參量振蕩器、光參量放大器或Cr:forsterite激光器產生）和1700nm窗口（由光孤子源激發(fā)）。這些窗口在腦組織中的衰減呈現(xiàn)局部最小值，有利于將彈道光子傳遞到焦點。例如，Demirhan Kobat等人采用1280nm激發(fā)對小鼠大腦中熒光標記的脈管系統(tǒng)成像，達到了散射組織中多光子成像的基本深度極限；Dimitre G.Ouzounov等人使用1300nm激發(fā)的三光子成像對小鼠海馬體中的神經元成像，成像深度約1mm；H Cheng 等人采用圓偏振孤子自頻移技術在1617nm處產生高能飛秒脈沖，對小鼠體內深腦脈管系統(tǒng)成像，深度達2000μm；Hongji Liu等人使用自制飛秒激光器進行1700nm窗口的三光子激發(fā)，實現(xiàn)了小鼠大腦表面以下2100μm血管的可視化及1600μm深度處的血流動力學成像。此外，2200nm窗口在生物組織中的衰減也呈局部最小值，但成像深度和空間分辨率不如1700nm激發(fā)，因此1700nm窗口仍是當前實現(xiàn)最深多光子腦成像的光學窗口。
二、結合自適應光學
1、成像質量下降的原因
盡管長波長激發(fā)可減輕散射效應，但隨著成像深度增加，成像質量會迅速下降。這是因為不均勻的樣本會使激發(fā)光的波前發(fā)生畸變，引入偽影。此外，高數(shù)值孔徑油鏡的浸入介質與樣品之間的折射率不匹配、光學元件的離軸傳輸以及光學元件的缺陷等因素都會導致像差，使激發(fā)光的焦點光斑尺寸增大且強度減小，限制了深層組織的高質量成像。
2、自適應光學技術的應用與效果
自適應光學技術是解決多光子成像波前校正的主要方法，其典型系統(tǒng)包括波前探測和波前校正兩個部分。波前探測分為直接波前測量法（利用波前傳感器直接測量畸變波前，測量速度快，但需引入外源染料，不利于厚組織或多層樣品）和間接波前探測法（基于迭代算法，通過一系列圖像間接推導出波前，速度較慢但適合不透明介質，其替代方案如相干門控波前傳感、瞳孔分割和自適應迭代補償技術等廣泛應用于腦部組織成像）。波前校正器（如可變形鏡和空間光調制器）通過改變波前相位來校正畸變波前。
許多自適應光學技術已應用于多光子顯微鏡。S.Leemans等人開發(fā)的3D自適應光學系統(tǒng)，在顯微鏡激發(fā)路徑中集成可變形鏡，采用基于下坡單純形算法的波前優(yōu)化方法，能對小鼠大腦 2mm深度處的運動神經元成像，提高了圖像分辨率和亮度；Lina Streich等人將自適應光學技術應用于三光子顯微鏡進行小鼠大腦活體成像，采用實時心電圖門控圖像采集方案減少運動偽影，結合基于模態(tài)的間接AO法與連續(xù)膜可變形鏡，可對皮層和海馬體中的精細結構成像，圖像質量和空間分辨率顯著改善，軸向分辨率提升四倍，熒光信號增強八倍。
三、結合GRIN透鏡
1、現(xiàn)有措施的局限性與內窺鏡檢查方式的引入
盡管采取了上述措施，在小鼠大腦中成像深度仍限制在1-2mm。為對更深層皮質下結構成像，可采用內窺鏡檢查方式，通過插入薄成像探針觀察器官內部，其中GRIN透鏡被廣泛用于大腦體內成像。
2、GRIN透鏡的特點與應用實例
GRIN透鏡是微型棒狀透鏡，具有接近拋物線形狀的徑向折射率曲線，直徑可小于1mm，能嵌入組織內部傳遞激發(fā)和發(fā)射光。結合高數(shù)值孔徑GRIN透鏡的多光子內窺鏡技術可解析深層組織亞細胞結構。例如，Miriam E.Bocarsly等人開發(fā)的微創(chuàng)多光子微內窺鏡系統(tǒng)，采用0.5NA、直徑0.5mm的GRIN透鏡，結合遺傳編碼鈣指示劑GCaMP6s，能對小鼠大腦深層結構（如紋狀體、黑質和外側下丘腦）的神經元和神經元活動進行雙光子熒光成像；Masaaki Sato等人采用直徑1.8mm、長度16.9mm的GRIN透鏡和電可調透鏡構成的快速變焦雙光子微內窺鏡系統(tǒng)，可使麻醉小鼠的CA1海馬體和杏仁核神經元可視化；Yu-Feng Chien等人將GRIN透鏡和可調諧聲學GRIN透鏡集成到雙光子顯微鏡中，實現(xiàn)了對小鼠大腦底部視交叉上核自發(fā)神經元活動的體內功能成像。然而，GRIN透鏡固有像差會限制成像分辨率和視野，可結合電可調液晶透鏡、衍射和折射光學元件、自適應光學器件等進行校正。此外，GRIN透鏡植入大腦可能導致組織創(chuàng)傷，開發(fā)非侵入性方法仍是深層腦組織成像的需求。
多光子腦成像成像速度進展
一、隨機掃描
1、傳統(tǒng)掃描機制的局限性與隨機掃描的優(yōu)勢
多光子成像速度受激發(fā)焦點連續(xù)掃描速度限制，典型雙光子顯微鏡幀速率較慢。傳統(tǒng)多光子顯微鏡使用振鏡進行2D掃描，雖有共振掃描儀等快速掃描機制，但仍受掃描鏡物理速度限制且需克服慣性。隨機掃描機制可有效避免這些問題，激光束能在整個視場任意選定點快速掃描，可只掃描感興趣點，且由于激光束在信號產生區(qū)域停留時間增加，系統(tǒng)獲取信號量增多，圖像信噪比得以提高。
實現(xiàn)隨機掃描常用聲光偏轉器（AOD），其通過聲光衍射效應使入射光在一定角度范圍內掃描，掃描頻率可超250KHz，且所有掃描位置激光功率均勻，結合其他軸向掃描技術可實現(xiàn)3D隨機掃描。例如，Kelly D.R.Sakaki等人開發(fā)的雙光子顯微鏡采用兩個AOD進行X軸和Y軸掃描及壓電致動器進行Z軸掃描，能對神經元樹突棘進行高分辨率飽和采樣。然而AOD會引入空間和時間色散，導致脈沖展寬和光束失真，降低信號強度和圖像質量。為解決此問題，研究人員開發(fā)了多種補償方案，如使用擴散光柵等色散元件在相反方向引入空間色散來最小化總量，或使用棱鏡或額外AOD校正空間和時間色散，使基于AOD的掃描機制廣泛應用于多光子顯微鏡，實現(xiàn)高時空分辨率的隨機掃描。
二、多焦點成像
1、多焦點成像的原理與優(yōu)勢
多焦點成像通過同時激發(fā)和檢測多個位置的信號來提高數(shù)據(jù)獲取速度且不損失信噪比，成為提升多光子成像速度的策略之一。在多焦點成像中，一束平行光垂直入射到多焦點光學元件后在軸向或垂軸平面形成多個焦點，常用多焦點光學元件包括Nipkow盤、分束器陣列、微透鏡陣列、衍射光學元件和空間光調制器等。
2、多焦點成像技術的應用與問題解決
Chenyang Wen等人利用二元全息圖控制聚焦光點位置和強度，結合多焦點壓縮傳感算法重建3D圖像，提高了成像性能；Simon P.Poland等人開發(fā)的多焦點多光子熒光壽命顯微鏡包含8×8超快光束陣列，通過并行激發(fā)和檢測使采集速度大幅提高。然而，多焦點多光子技術存在成像質量和速度的矛盾，增加焦點數(shù)目可提高速度，但會因焦點間相干干擾降低分辨率。通過不同光束的相位復用、使用不同偏振態(tài)光束以及延長每個焦點相對于相鄰焦點的時間等方法可有效解決此問題。
三、貝塞爾光束照明
1、擴展焦深成像與貝塞爾光束的特點
在多光子三維成像中，傳統(tǒng)掃描方式耗時多，擴展焦深成像通過犧牲軸向圖像信息，利用貝塞爾光束擴展焦深，在一次橫向掃描中實現(xiàn)體積掃描，可大大提高成像速度，適用于高時間分辨率的稀疏群體結構成像，如神經元活動的功能成像。貝塞爾光束具有軸向延展的針狀光強度分布，在保持橫向分辨率的同時延伸了焦深，能同時從不同深度獲取信號。對于標記較稀疏的樣品，長焦深貝塞爾光束可監(jiān)測更大體積活動；對于標記密集的樣品，短焦深貝塞爾光束可減少結構重疊。
2、貝塞爾光束在多光子顯微鏡中的應用實例
Bingying Chen等人將貝塞爾光束照明應用于三光子顯微鏡，對活果蠅大腦特定區(qū)域成像，速度達1Hz，相比點掃描三光子顯微鏡優(yōu)勢明顯；Rongwen Lu等人開發(fā)的基于軸錐鏡的貝塞爾光束模塊成本低、占用空間小且對光偏振不敏感，集成到雙光子熒光顯微鏡中對斑馬魚幼蟲神經元成像，速度達50Hz，能對更多神經元成像；Jiang Lan Fan等人使用具有軸向擴展貝塞爾焦點的雙光子激光掃描顯微鏡進行神經血管動力學成像，實現(xiàn)了大體積（1.4mm×1.4mm×110μm）和高速（99Hz）下的結構和功能成像，且橫向分辨率足以解析單個毛細血管，表明貝塞爾焦點掃描在提高體積成像通量的同時不影響橫向分辨率。
多光子腦成像裝置小型化
一、傳統(tǒng)裝置的局限性與小型化的必要性
傳統(tǒng)多光子腦成像通常依賴大型臺式顯微鏡，動物頭部需固定在物鏡下方，這嚴重限制了可研究的行為類型，給動物帶來不適和壓力。因此，將掃描機構、光學系統(tǒng)、信號收集組件和飛秒激光器小型化，發(fā)展頭戴式多光子顯微鏡成為重要研究方向。
研究人員探索了多種適用于微型雙光子顯微的掃描機制，其中光纖掃描頭和微機電系統(tǒng)（Microelectro Mechanical Systems，MEMS）掃描鏡較為常見。MPM的典型激光源 Ti:Sapphire超快激光器體積龐大、對準要求高，不適用于臨床環(huán)境，而光纖激光器結構緊湊、無需對準且價格便宜，在微型化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。聚焦光學系統(tǒng)的小型化可通過使用緊湊的高數(shù)值孔徑光學系統(tǒng)實現(xiàn)。
三、小型化顯微鏡的發(fā)展歷程與實例
1、早期嘗試與不足
2001年，Denk等人研制出第一臺光纖共振掃描雙光子頭戴式顯微鏡，但成像性能不佳。2009年，Kerr等人展示的小型化雙光子光纖內窺鏡系統(tǒng)雖空間分辨率有所提高（因應用微型物鏡NA 0.9），但探頭重量增加（5.5g），且由于仍使用光纖共振掃描，成像速度較慢。同年，M.J.Schnitzer等人建造的基于MEMS掃描儀的便攜式雙光子顯微鏡重量僅2.9g，成功對小鼠大腦新皮質表面附近血管成像，但其掃描頻率（對于400×135像素約為4Hz）和空間分辨率（橫向分辨率約1.29μm，軸向分辨率約10.3μm）未達要求。
2、近年來的進展與突破
2018年，Baris N.Ozbay等人開發(fā)的頭戴式雙光子光纖耦合顯微鏡（2P-FCM）具有主動軸向掃描功能，采用電潤濕可調諧透鏡，操作簡單、尺寸和重量小且不受振動影響，能快速改變3D成像焦點。該系統(tǒng)使用柔性相干光纖束作為光學繼電器，結合臺式激光掃描雙光子顯微鏡，實現(xiàn)了大視場成像和一定深度的軸向掃描，成像橫向分辨率為1.8μm，軸向分辨率為10μm，成功對自由移動小鼠軀體感覺皮層神經元成像。
2019年，Jin Cheng等人簡化雙光子顯微鏡結構，定制二向色性MEMS掃描儀，形成超小型線陣掃描非線性光學顯微鏡，總尺寸�。s7mm×6.5mm×3mm），重量輕（0.25g），成像速度高達每秒數(shù)千幀，可同時在單個動物上安裝多個（最多4個）進行成像。
2017年，Chen等人推出基于MEMS掃描儀的新型頭戴式雙光子顯微鏡，使用920nm光子晶體光纖傳輸飛秒激光脈沖，性能與大型臺式相當，重量僅2.15g，橫向分辨率和軸向分辨率分別為0.64μm、3.35μm，柵掃描頻率和線掃頻率較高，可對自由移動小鼠中單棘活動成像。2021年，該團隊研發(fā)的第二代快速、高分辨率、小型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM 2.0）成像視野擴大，嵌入可拆卸快速軸向掃描模塊，實現(xiàn)了180μm深度的三維成像和多平面快速切換的實時成像，可長期追蹤記錄神經元，微型物鏡工作距離擴展，變焦模塊可自由拆卸，新版成像探頭可整體即時拔插，簡化實驗操作，視場旋轉角和邊界偏差小，增強了微型雙光子顯微鏡的適用性和實用性。
總結與展望
多光子成像技術在腦科學研究中占據(jù)重要地位，其亞微米級空間分辨率、大成像深度、低生物損傷性和三維成像能力為研究大腦微觀結構與生理過程、理解腦部疾病發(fā)病機制提供關鍵手段。
現(xiàn)有技術在成像深度上通過長波長激發(fā)、自適應光學模塊和GRIN透鏡等提升，成像速度借助隨機掃描、多焦點成像和貝塞爾光束照明等提高，掃描機構等小型化發(fā)展出頭戴式顯微鏡提高適用性。
未來，多光子成像將向多色成像（發(fā)展多波長激光等光源）、大視場多腦區(qū)成像（開發(fā)單個成像系統(tǒng)多區(qū)域成像技術）、集合多模態(tài)成像（結合其他技術增加探測維度）、結合5G與人工智能（實現(xiàn)高速數(shù)據(jù)傳輸與分析助力腦部疾病診斷）方向發(fā)展，盡管目前多光子腦成像研究在動物模型應用到人腦面臨困難，但隨著光學器件優(yōu)化及數(shù)據(jù)處理方法改進，有望取得更多突破，為人類健康和科學發(fā)展助力。
聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：薛璐, 徐彬, 熊吉川, 劉學峰. 多光子顯微在腦成像中的應用及進展[J]. 激光與光電子學進展, 2023, 60(20): 02.
