2. 基質(zhì)細(xì)胞、髓系細(xì)胞和T細(xì)胞亞型的缺氧評(píng)分
為了評(píng)估TME中這些主要細(xì)胞類型的缺氧水平，我們對(duì)來自癌癥組織的細(xì)胞進(jìn)行了亞聚類分析，并計(jì)算了癌癥類型中每個(gè)亞型的缺氧評(píng)分。基質(zhì)細(xì)胞的亞簇主要分為三大類：周細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（補(bǔ)充圖2A）。由于SCC中幾乎沒有成纖維細(xì)胞（710個(gè)細(xì)胞），我們未能對(duì)該癌癥中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行亞分類，而對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的其余研究集中于其他五種癌癥類型。我們以標(biāo)記的形式按順序命名成纖維細(xì)胞簇（例如，F(xiàn)S1和FS2分別是簇0和1）。根據(jù)先前研究的標(biāo)志物（Costa et al.，2018；Kieffer et al.，2020）和每個(gè)簇中顯著上調(diào)的基因，我們將成纖維細(xì)胞稱為特定癌癥類型中的膠原蛋白相關(guān)CAF、趨化因子相關(guān)CAF和白細(xì)胞介素（IL）信號(hào)相關(guān)CAF。白細(xì)胞介素信號(hào)相關(guān)CAF[BC中的FS5（簇4）]上調(diào)了炎癥特征，如BC中的干擾素反應(yīng)和炎癥反應(yīng)（圖2A）。六種癌癥類型的膠原相關(guān)CAF[FS1（簇0）]表現(xiàn)出最高的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑得分（補(bǔ)充圖2B）。然而，癌癥類型的CAF缺氧評(píng)分沒有一致的趨勢(shì)。

從兩個(gè)方面對(duì)髓樣細(xì)胞進(jìn)行了研究，包括亞型鑒定和炎癥特征評(píng)估。使用常規(guī)標(biāo)記基因，我們鑒定了樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)了所有癌癥類型的共同亞群（補(bǔ)充圖2C）。我們根據(jù)先前研究中引用的標(biāo)記物/基因集區(qū)分了促炎和抗炎單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（Azizi等人，2018；圖2B和補(bǔ)充圖3A）。然而，一些特定的TAM具有混合表型，表達(dá)促炎和抗炎特征以及M1和M2基因特征（圖2B和補(bǔ)充圖2C、3A），與之前的研究一致（Lee等人，2020）。值得注意的現(xiàn)象是，SPP1在一個(gè)亞型中表達(dá)較高，如BC中的M-S1（簇0）；CRC中的M-S3（簇2）；LC中的M-S1（簇0）和M-S2（簇1）；OV中的M-S1（簇0）和M-S5（簇4）；PDAC中的M-S2（簇1）；以及SCC中的M-S3（簇2），其在六種癌癥類型中普遍存在（圖2B和補(bǔ)充表2）。我們將這些亞型命名為SPP1+TAM，發(fā)現(xiàn)與ECM重塑相關(guān)的基質(zhì)金屬肽酶9（MMP9）也在SPP1+TAMs中高度表達(dá)（圖2B）。值得注意的是，與其他亞型相比，SPP1+TAM的缺氧評(píng)分更高（圖2B）。鑒于SPP1+TAM的上述特征，它們可能在缺氧TME的影響下在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮核心作用。

T/NK細(xì)胞的亞群導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的鑒定（補(bǔ)充圖3C）。我們打算通過關(guān)鍵抑制性受體（PDCD1、TIGIT、HAVCR2、LAG3和CTLA4）的基因表達(dá)來鑒定CD8+T細(xì)胞的耗竭狀態(tài)（補(bǔ)充圖3C）。然而，表達(dá)耗竭基因的細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞中也高度表達(dá)細(xì)胞毒性標(biāo)志物（GZMB和IFNG），這進(jìn)一步證實(shí)了一個(gè)特定的亞群高度表現(xiàn)出細(xì)胞毒性評(píng)分和耗竭評(píng)分（補(bǔ)充圖3D）。如補(bǔ)充圖3D所示，與其他簇相比，CRC中的CD8-S3（簇4）表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性和耗竭評(píng)分。這一觀察結(jié)果似乎是一個(gè)與之前的scRNA-seq研究類似的激活依賴性耗竭表達(dá)程序（Guo等人，2018）。出乎意料的是，耗盡的CD4+T細(xì)胞[CD4-S5（簇4）在BC；CD4-S9（簇8）在CRC；CD4-S6（簇5）在LC；CD4-S4（簇3）在PDAC；和CD4-S4在SCC]在五種癌癥類型中被區(qū)分。由于之前的一項(xiàng)研究（Scharping等人，2021）表明T細(xì)胞耗竭是在缺氧環(huán)境下驅(qū)動(dòng)的，因此有人認(rèn)為缺氧和耗竭之間可能存在關(guān)聯(lián)。然后，我們進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)缺氧評(píng)分與六種癌癥類型T細(xì)胞的衰竭評(píng)分高度相關(guān)，但與細(xì)胞毒性評(píng)分無關(guān)（圖2D）。
 

3. 惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性及其與缺氧的關(guān)系
我們獲得了惡性上皮細(xì)胞亞群和每個(gè)亞群的DEGs。接下來，我們探討了同一癌癥類型中不同癌癥細(xì)胞的表達(dá)狀態(tài)如何變化，并應(yīng)用了反映癌癥相關(guān)標(biāo)志性途徑活性的GSVA。一些亞群的GSVA分布顯示，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管生成相關(guān)的基因顯著富集，而一些亞群在細(xì)胞周期相關(guān)的標(biāo)志物中高度富集：E2F/MYC靶點(diǎn)和G2M檢查點(diǎn)，表明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖3）。值得注意的是，觀察到高缺氧亞群與EMT程序亞群相同。妊娠早期STB中的亞型特異性增強(qiáng)子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
 

4. 骨髓基質(zhì)細(xì)胞與癌癥細(xì)胞的串?dāng)_
為了破譯細(xì)胞間相互作用的分子關(guān)聯(lián)，我們使用潛在的配體-受體（L-R）對(duì)相互作用構(gòu)建了不同細(xì)胞亞型之間的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)（補(bǔ)充圖4A和補(bǔ)充表5）。重要的是，癌癥細(xì)胞和髓細(xì)胞之間的相互作用數(shù)量被預(yù)測(cè)為六種癌癥類型細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中最普遍的（補(bǔ)充圖4A）。此外，我們接下來分析了患者中這些亞簇之間的各自比例之間是否存在任何相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)了一些共現(xiàn)的細(xì)胞亞簇（補(bǔ)充圖4B和補(bǔ)充表6），例如一些成纖維細(xì)胞和癌癥細(xì)胞亞簇之間在BC和OV中相關(guān)的比例。

鑒于癌癥細(xì)胞與髓細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞之間的串?dāng)_被預(yù)測(cè)為普遍存在，我們重點(diǎn)分析了這些細(xì)胞類型之間的相互作用，并詢問了它們?nèi)绾我蕴囟ǚ绞较嗷ビ绊懸源龠M(jìn)癌癥進(jìn)展（圖4A和補(bǔ)充圖5）。在BC和OV中，基質(zhì)細(xì)胞是與癌癥細(xì)胞相互作用的廣泛細(xì)胞類型（圖4A和補(bǔ)充圖5）。胰島素樣生長因子1（IGF1）可由基質(zhì)細(xì)胞分泌，通過結(jié)合其在癌癥細(xì)胞上的受體來調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的生長。癌癥細(xì)胞表達(dá)的胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）基因與BC中的雌激素反應(yīng)信號(hào)高度相關(guān)，這可能表明IGF1對(duì)IGF1R的結(jié)合作用以及激活雌激素信號(hào)增強(qiáng)了癌癥的生長（圖4B）。S型蛋白酪氨酸磷酸酶受體（PTPRS）在OV癌癥細(xì)胞中高度表達(dá)，并與MYC/E2F靶點(diǎn)相關(guān)，表明多效性蛋白（PTN）由與其受體結(jié)合的成纖維細(xì)胞分泌，以促進(jìn)癌癥細(xì)胞生長（圖4B）。相應(yīng)地，IGF1R和PTPRS的表達(dá)分別與BC和OV中的雌激素反應(yīng)相關(guān)基因ESR1和MYC靶基因SLC2A1呈正相關(guān)（圖4B）。此外，癌癥細(xì)胞亞簇[CS1（簇0）]和間質(zhì)細(xì)胞亞簇（FS3和FS4）的比例在BC中也顯示出正相關(guān)（圖4C）。這些結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞可能通過表達(dá)和分泌不同的生長因子來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。
 

5. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)癌癥細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)移
為了研究巨噬細(xì)胞通過常見的L–R對(duì)（TNFSF12–TNFRSF12A和SPP1–CD44）對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性影響，我們進(jìn)一步計(jì)算了癌癥細(xì)胞中TNFRSF12 A或CD44表達(dá)與標(biāo)志性特征評(píng)分之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，血管生成、糖酵解和EMT是與CD44表達(dá)最相關(guān)的生物學(xué)過程，而在癌癥細(xì)胞中，通過NFκB、血管生成、IL6_JAK_STAT3途徑和EMT的TNFα信號(hào)傳導(dǎo)與CRC、LC和SCC中的TNFRSF12A相關(guān)（圖5A和補(bǔ)充表7）。由于SPP1主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)（補(bǔ)充圖6A），我們進(jìn)一步檢測(cè)到SPP1+TAMs的相對(duì)豐度[LC中的M-S2（簇1）和CRC中的M-S3（簇2）]以及EMT高的癌癥細(xì)胞亞簇[CC中的CS1（簇0）和CRC中的CS2（聚類1）]在LC和CRC中相互關(guān)聯(lián)，這進(jìn)一步加強(qiáng)了SPP1+TAM促進(jìn)EMT的功能（補(bǔ)充表2和圖5B）。
 

6. SPP1在缺氧腫瘤微環(huán)境中上調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)
由于發(fā)現(xiàn)SPP1+TAM具有較高的缺氧評(píng)分（圖2B）和與EMT癌癥細(xì)胞共現(xiàn)（圖5B），我們專注于探索SPP1和SPP1+TAMs的功能。與正常組織相比，腫瘤樣本來源的巨噬細(xì)胞中SPP1的表達(dá)上調(diào)（圖6A）；我們推斷SPP1是TAMs中TME誘導(dǎo)的特異性表達(dá)程序。TCGA癌癥樣本進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，表明與鄰近的正常組織相比，在相應(yīng)的癌癥類型中觀察到腫瘤組織中SPP1的表達(dá)高得多（補(bǔ)充圖7A）。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)PDAC和LC含有更高比例（>50%）的SPP1+TAM（補(bǔ)充圖7B）。利用從TCGA項(xiàng)目收集的臨床數(shù)據(jù)，我們證實(shí)，SPP1基因表達(dá)水平較高的患者在六種癌癥類型中表現(xiàn)出較差的預(yù)后，包括本研究中研究的癌癥（圖6B），SPP1+TAM比例較高也與較差的臨床結(jié)果相關(guān)（補(bǔ)充圖7C），表明SPP1和SPP1+TAMs對(duì)癌癥的臨床影響。