翻譯組學(xué)研究技術(shù)介紹和應(yīng)用
翻譯組學(xué)簡介
Ribo-seq技術(shù)應(yīng)用方向
案例六：病毒感染
文章標(biāo)題：Dissecting infectious bronchitis virus-induced host shutoff at the translation level.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq繪制了傳染性支氣管炎病毒(IBV)感染細胞的翻譯景觀，并證明了IBV誘導(dǎo)宿主基因關(guān)閉以促進其復(fù)制的新策略。
Guo Y, Yan S, Zhang W. 2023. Translatomics to explore dynamic differences in immunocytes in the tumor microenvironment. Mol Ther Nucleic Acids. 34, 102037.
Su D, Ding C, Qiu J, et al. 2024. Ribosome profiling: a powerful tool in oncological research. Biomark Res. 12(1):11.
Zhang S, Chen Y, Wang Y, Zhang P, Chen G, Zhou Y. 2020. Insights into translatomics in the nervous system. Front Genet. 11:599548.
Goodarzi H, Nguyen HCB, Zhang S, et al. 2016. Modulated expression of specific tRNAs drives gene expression and cancer progression. Cell. 165(6):1416-1427.
Kim JW, Yin X, Jhaldiyal A, et al. 2020. Defects in mRNA translation in LRRK2-Mutant hiPSC-Derived dopaminergic neurons lead to dysregulated calcium homeostasis. Cell Stem Cell. 27(4):633-645.e7.
van Heesch S, Witte F, Schneider-Lunitz V, et al. 2019. The translational landscape of the human heart. Cell. 178(1):242-260.e29.
Duffy EE, Finander B, Choi G,et al. 2022. Developmental dynamics of RNA translation in the human brain. Nat Neurosci. 25(10):1353-1365.
Xiang Y, Huang W, Tan L, et al. 2023. Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection. Nature. 621(7978):423-430.
Zhao J, Huang Y, Liukang C, et al. 2024. Dissecting infectious bronchitis virus-induced host shutoff at the translation level. J Virol. 98(7):e0083024.
轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能夠評估蛋白質(zhì)的表達水平，然而，越來越多的研究結(jié)果表明，mRNA的豐度和蛋白質(zhì)的豐度存在較大差異。這主要是由于在翻譯過程中存在復(fù)雜的調(diào)控機制。蛋白質(zhì)可以通過質(zhì)譜技術(shù)直接量化蛋白質(zhì)的豐度，但無法檢測出mRNA的翻譯效率和蛋白質(zhì)的合成速率。因此，迫切需要一種創(chuàng)新性技術(shù)，成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的重要橋梁和樞紐。因此，翻譯組學(xué)恰逢其時地應(yīng)運而生。
在核糖體上以mRNA為模板進行翻譯的示意圖
翻譯組學(xué)(Translatomics)是一種對核糖體結(jié)合的RNA進行捕獲和測序的技術(shù)，通過對正在翻譯的RNA分子進行測序和分析，可以精確地量化從基因到蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，并比較不同處理下，蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)控機制。翻譯水平的調(diào)節(jié)是蛋白質(zhì)豐度的關(guān)鍵決定因素，而蛋白質(zhì)豐度又進一步調(diào)節(jié)細胞狀態(tài)。對于蛋白質(zhì)來說，翻譯水平的調(diào)控程度超過了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA代謝和蛋白質(zhì)代謝調(diào)控過程的總和。翻譯調(diào)控是細胞內(nèi)一種重要的調(diào)控機制，它能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對蛋白質(zhì)的合成進行精確控制，而且在生物體的生長、發(fā)育、代謝等多種生物學(xué)過程都發(fā)揮非常重要的作用。從基因組到轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控研究成果有很多，相比之下，缺乏從轉(zhuǎn)錄組到蛋白質(zhì)組的調(diào)控研究成果，而翻譯組作為轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的橋梁，彌補了這一短板。隨著翻譯組學(xué)技術(shù)的運用，我們能夠更加全面并且準(zhǔn)確地獲得翻譯過程中的各種信息，包括翻譯效率、翻譯起始、翻譯終止等，這也為我們發(fā)現(xiàn)新的翻譯調(diào)控機制提供了強有力的技術(shù)支持。
翻譯組學(xué)研究技術(shù)
目前，翻譯組學(xué)的研究方法有：多聚核糖體圖譜(polysome profiling)、翻譯核糖體親和純化測序(TRAP-seq或RiboTag-seq)、核糖體印跡測序(Ribo-seq)、核糖體-新生肽鏈復(fù)合物測序(RNC-seq)和單細胞核糖體印跡測序(scRibo-seq)。
翻譯組研究技術(shù)概括
• Polysome profiling：通過蔗糖梯度超速離心分離free mRNA、40S和60S核糖體亞基、單核糖體和多聚核糖體，收集含有多聚核糖體的部分用于RNA或蛋白質(zhì)分析。
優(yōu)點：可以檢測核糖體密度分布；對胞質(zhì)RNA做分級。
缺點：需要特定的設(shè)備；需要投入的樣品量較多；操作復(fù)雜耗時長；可能存在假多聚體和脂質(zhì)顆粒的污染；不能提供核糖體的位置信息。
• TRAP-seq：通過轉(zhuǎn)基因手段給感興趣的核糖體帶上親和純化標(biāo)簽，并使用組織特異性啟動子控制該標(biāo)簽的表達。帶標(biāo)簽的核糖體以及與之結(jié)合、正在翻譯的mRNA可以被特定的抗體捕獲，去除rRNA后，可進一步開展RNA-seq或Microarray檢測。
優(yōu)點：檢測具有細胞特異性。
缺點：難點在于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細胞或動物模型；親和標(biāo)簽可能干擾核糖體功能；不能提供核糖體的位置信息。
• Ribo-seq：細胞裂解后，用RNase將不受核糖體保護的RNA區(qū)域切割和消化，并在去除rRNA后，對核糖體保護片段（RPF）進行深度測序生成核糖體譜，可以提供核糖體在翻譯mRNA上的位置及定量信息。
優(yōu)點：能夠檢測核糖體密度分布；明確核糖體位置信息；發(fā)現(xiàn)新的非典型ORFs；破譯翻譯調(diào)控機制。
缺點：需要特定的設(shè)備；需要投入的樣品量較多；操作復(fù)雜耗時長；可能存在假RPFs的污染；冗余的生物信息。
• RNC-seq：與Polysome profiling不同，RNC-seq采用30%蔗糖緩沖液，通過超速離心分離核糖體相關(guān)的翻譯mRNA，收集沉淀中的RNC-mRNA，回收的RNC-mRNA可以保存全長信息。
優(yōu)點：回收率更高；沒有蔗糖污染；獲得全長mRNA。
缺點：RNC脆弱易斷；不同核糖體數(shù)目的RNC混合分析；不能提供核糖體的位置信息。
• scRibo-seq：將單細胞用含有放線菌酮(CHX)的裂解液進行裂解，并用微球菌核酸酶（MNase）酶切釋放RPF，之后構(gòu)建文庫，選擇具有典型RPF長度的片段進行深度測序。
優(yōu)點：單細胞的翻譯檢測；無需標(biāo)記及轉(zhuǎn)基因材料；適用于稀有的原代樣品。
缺點：相對較低的靈敏度和準(zhǔn)確度；丟失了空間和時間信息；生物或技術(shù)噪音。
總之，這些翻譯組學(xué)研究技術(shù)各有優(yōu)勢，研究者可以根據(jù)具體的研究目的和實驗條件選擇合適的技術(shù)。如果需要直接測定翻譯效率、鑒定翻譯起始位點、鑒定uORF以及新型的microProtein，Ribo-seq是更好的選擇；如果需要了解翻譯效率的直觀圖譜，Polysome profiling更合適；如果需要獲得特定細胞或組織的翻譯信息，TRAP-seq更合適；如果需要了解核糖體的組成和活性，RNC-seq更有用。
Ribo-seq技術(shù)應(yīng)用思路
基于翻譯組學(xué)技術(shù)，科學(xué)家們在翻譯調(diào)控研究方面已經(jīng)取得了一系列重要成果。我們以Ribo-seq為例，簡要總結(jié)了翻譯組學(xué)的研究思路。
（1）研究基礎(chǔ)：確定研究目的，制備樣品，開展Ribo-seq測序。
（2）研究進階：個性化數(shù)據(jù)分析，必要的實驗驗證和功能研究。
（3）研究升華：多組學(xué)聯(lián)合分析，充分的實驗驗證，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控機制，具備潛在應(yīng)用價值。
（1）研究基礎(chǔ)：確定研究目的，制備樣品，開展Ribo-seq測序。
（2）研究進階：個性化數(shù)據(jù)分析，必要的實驗驗證和功能研究。
（3）研究升華：多組學(xué)聯(lián)合分析，充分的實驗驗證，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控機制，具備潛在應(yīng)用價值。
Ribo-seq是一種針對細胞中核糖體以及核糖體保護的mRNA片段的研究技術(shù)，能在全基因組范圍內(nèi)、高分辨率的定量分析正在翻譯的mRNA。該方法已在許多動物、植物和微生物研究中被應(yīng)用，并且揭示了有關(guān)翻譯過程的許多調(diào)控機制。
在癌癥研究中，通過翻譯組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)癌癥細胞中異常激活的翻譯調(diào)控途徑，為癌癥治療提供新靶點。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些癌癥細胞中eIF4E的表達水平升高，通過抑制eIF4E活性可抑制腫瘤生長。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究方面，研究了阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的翻譯調(diào)控異常，為疾病診斷和治療提供線索。例如，研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者大腦中某些mRNA的翻譯效率降低，可能與疾病發(fā)病機制相關(guān)。在自身免疫性疾病研究中，分析免疫細胞在炎癥、感染等過程中的翻譯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示免疫應(yīng)答的分子機制。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些炎癥因子可通過調(diào)控翻譯起始過程影響免疫細胞的功能。在代謝性疾病方面，翻譯調(diào)控在胰島素信號通路和葡萄糖代謝中發(fā)揮作用，與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生有關(guān)。在心血管疾病方面，翻譯調(diào)控影響心臟細胞的生長和功能，可能與心力衰竭等心血管疾病相關(guān)。許多遺傳性疾病，如囊性纖維化、杜氏肌肉萎縮癥和某些類型的遺傳性心臟病，都涉及翻譯調(diào)控的異常。在生長發(fā)育生物學(xué)方面，研究胚胎發(fā)育過程中的翻譯調(diào)控，揭示細胞分化和器官形成的分子機制。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些mRNA在胚胎發(fā)育過程中的翻譯調(diào)控對細胞命運決定具有關(guān)鍵作用。在藥物研發(fā)方面，基于翻譯組學(xué)發(fā)現(xiàn)的藥物靶點，設(shè)計新型藥物，為疾病治療提供新策略。例如，針對翻譯起始因子eIF2B的抑制劑可用于治療某些遺傳性疾病。在感染性疾病研究方面，病原體（如：病毒和細菌）可能通過操縱宿主細胞的翻譯機制來促進自身的復(fù)制和存活。
在癌癥研究中，通過翻譯組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)癌癥細胞中異常激活的翻譯調(diào)控途徑，為癌癥治療提供新靶點。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些癌癥細胞中eIF4E的表達水平升高，通過抑制eIF4E活性可抑制腫瘤生長。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究方面，研究了阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的翻譯調(diào)控異常，為疾病診斷和治療提供線索。例如，研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者大腦中某些mRNA的翻譯效率降低，可能與疾病發(fā)病機制相關(guān)。在自身免疫性疾病研究中，分析免疫細胞在炎癥、感染等過程中的翻譯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示免疫應(yīng)答的分子機制。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些炎癥因子可通過調(diào)控翻譯起始過程影響免疫細胞的功能。在代謝性疾病方面，翻譯調(diào)控在胰島素信號通路和葡萄糖代謝中發(fā)揮作用，與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生有關(guān)。在心血管疾病方面，翻譯調(diào)控影響心臟細胞的生長和功能，可能與心力衰竭等心血管疾病相關(guān)。許多遺傳性疾病，如囊性纖維化、杜氏肌肉萎縮癥和某些類型的遺傳性心臟病，都涉及翻譯調(diào)控的異常。在生長發(fā)育生物學(xué)方面，研究胚胎發(fā)育過程中的翻譯調(diào)控，揭示細胞分化和器官形成的分子機制。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些mRNA在胚胎發(fā)育過程中的翻譯調(diào)控對細胞命運決定具有關(guān)鍵作用。在藥物研發(fā)方面，基于翻譯組學(xué)發(fā)現(xiàn)的藥物靶點，設(shè)計新型藥物，為疾病治療提供新策略。例如，針對翻譯起始因子eIF2B的抑制劑可用于治療某些遺傳性疾病。在感染性疾病研究方面，病原體（如：病毒和細菌）可能通過操縱宿主細胞的翻譯機制來促進自身的復(fù)制和存活。
總之，翻譯組學(xué)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的具有重要的地位和應(yīng)用意義，隨著技術(shù)的不斷進步，Ribo-seq的應(yīng)用將會更加廣泛。
Ribo-seq文章案例
案例一：癌癥研究
文章標(biāo)題：Modulated expression of specific tRNAs drives gene expression and cancer progression.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq與tRNA測序技術(shù)研究tRNA在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，發(fā)現(xiàn)tRNA ArgCCG和tRNA ArgUUC作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的促進因子，通過直接增強EXOSC2的表達和增強GRIPAP1的翻譯來促進乳腺癌轉(zhuǎn)移。
文章標(biāo)題：Modulated expression of specific tRNAs drives gene expression and cancer progression.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq與tRNA測序技術(shù)研究tRNA在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，發(fā)現(xiàn)tRNA ArgCCG和tRNA ArgUUC作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的促進因子，通過直接增強EXOSC2的表達和增強GRIPAP1的翻譯來促進乳腺癌轉(zhuǎn)移。
案例二：神經(jīng)系統(tǒng)疾病
文章標(biāo)題：Defects in mRNA translation in LRRK2-Mutant hiPSC-Derived dopaminergic neurons leads to dysregulated calcium homeostasis.
研究內(nèi)容：該研究以帕金森病(PD)患者的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)分化成的多巴胺能神經(jīng)元為實驗材料，通過Ribo-seq分析，發(fā)現(xiàn)LRRK2基因G2019S位點突變會導(dǎo)致mRNA翻譯失調(diào)，進而影響鈣穩(wěn)態(tài)，并可能導(dǎo)致了帕金森病中多巴胺能神經(jīng)毒性。
文章標(biāo)題：Defects in mRNA translation in LRRK2-Mutant hiPSC-Derived dopaminergic neurons leads to dysregulated calcium homeostasis.
研究內(nèi)容：該研究以帕金森病(PD)患者的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)分化成的多巴胺能神經(jīng)元為實驗材料，通過Ribo-seq分析，發(fā)現(xiàn)LRRK2基因G2019S位點突變會導(dǎo)致mRNA翻譯失調(diào)，進而影響鈣穩(wěn)態(tài)，并可能導(dǎo)致了帕金森病中多巴胺能神經(jīng)毒性。
案例三：心血管疾病
文章標(biāo)題：The translational landscape of the human heart.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq技術(shù)研究擴張性心肌病(DCM)心肌組織的翻譯組，鑒定出169個lncRNA和40個circRNA編碼的新的微蛋白(microprotein)。
文章標(biāo)題：The translational landscape of the human heart.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq技術(shù)研究擴張性心肌病(DCM)心肌組織的翻譯組，鑒定出169個lncRNA和40個circRNA編碼的新的微蛋白(microprotein)。
案例四：生長發(fā)育
文章標(biāo)題：Developmental dynamics of RNA translation in the human brain.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq繪制人類大腦的全面的翻譯圖譜，揭示了基因表達調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點，識別了數(shù)千個未知的翻譯事件，包括編碼人類大腦特異性微蛋白的小開放閱讀框(sORF)。該研究對于理解人類大腦的特征和腦相關(guān)疾病具有重要意義。
文章標(biāo)題：Developmental dynamics of RNA translation in the human brain.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq繪制人類大腦的全面的翻譯圖譜，揭示了基因表達調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點，識別了數(shù)千個未知的翻譯事件，包括編碼人類大腦特異性微蛋白的小開放閱讀框(sORF)。該研究對于理解人類大腦的特征和腦相關(guān)疾病具有重要意義。
案例五：植物逆境脅迫
文章標(biāo)題：Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq、SHARP-MaP揭示了植物免疫過程中，mRNA的結(jié)構(gòu)變化動態(tài)調(diào)節(jié)了翻譯起始密碼子的選擇。促進抗病相關(guān)的mRNA翻譯效率提高，增強了植物的抗病性。
文章標(biāo)題：Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq、SHARP-MaP揭示了植物免疫過程中，mRNA的結(jié)構(gòu)變化動態(tài)調(diào)節(jié)了翻譯起始密碼子的選擇。促進抗病相關(guān)的mRNA翻譯效率提高，增強了植物的抗病性。
文章標(biāo)題：Dissecting infectious bronchitis virus-induced host shutoff at the translation level.
研究內(nèi)容：使用Ribo-seq繪制了傳染性支氣管炎病毒(IBV)感染細胞的翻譯景觀，并證明了IBV誘導(dǎo)宿主基因關(guān)閉以促進其復(fù)制的新策略。
以上這些案例，展示了Ribo-seq在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，從不同角度揭示了翻譯調(diào)控在正常生理及疾病過程中的重要作用，也為人們深入洞察生命科學(xué)的復(fù)雜機制和信號通路提供了技術(shù)支持。
參考文獻Guo Y, Yan S, Zhang W. 2023. Translatomics to explore dynamic differences in immunocytes in the tumor microenvironment. Mol Ther Nucleic Acids. 34, 102037.
Su D, Ding C, Qiu J, et al. 2024. Ribosome profiling: a powerful tool in oncological research. Biomark Res. 12(1):11.
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