MAXI-IMAGING-PAM應用于揭示番茄耐寒新機制
基因功能的分化主要由突變、基因復制和基因丟失驅動，對進化過程至關重要，其中順式調控區(qū)域的突變在轉錄調控的進化創(chuàng)新中起重要作用，但人們對其在作物進化過程中的變化和作用及其調控機制仍知之甚少。染色質重塑在控制轉錄機制對DNA的可及性方面起關鍵作用，環(huán)境應激可改變染色質結構從而影響轉錄調控，但環(huán)境應激誘導染色質動力學的機制和程度在很大程度上仍是未知的，且染色質動力學與轉錄反應之間的因果關系需要進一步闡明。SWIB/MDM2結構域蛋白在染色質重塑和基因表達調控中起關鍵作用，但這些蛋白在植物中尤其是在細胞核中直接結合DNA的能力仍未被探索。不同種的番茄具有不同程度的耐寒性，野生多毛番茄（Solanum habrochaites）被認為是最耐寒的番茄之一。由于生長環(huán)境的改變，在自然進化和人類選擇過程中，栽培番茄（Solanum lycopersicum）的耐寒性降低。冬春低溫對喜溫栽培番茄等設施農業(yè)作物構成重大威脅，導致其生長減緩、發(fā)育受損和產(chǎn)量降低。解析番茄耐寒能力下降的機制，培育耐寒種質和優(yōu)化栽培管理措施，對于設施農業(yè)發(fā)展具有重要意義。
2024年8月6日，Nature Communications在線發(fā)表了浙江大學喻景權院士團隊周杰教授為通訊作者題為Loss of cold tolerance is conferred by absence of the WRKY34 promoter fragment during tomato evolution的研究論文。研究團隊對冷敏感的栽培番茄和耐寒的野生多毛番茄進行ATAC-Seq和RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)WRKY34基因與冷脅迫下的染色質可及性和表達模式密切相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY34啟動子中的60bp InDel導致了不同番茄品種在轉錄和耐寒性上的差異，該片段中的GATA順式調控元件與SWIBs和GATA29結合，協(xié)同抑制WRKY34的表達。此外，WRKY34還通過調節(jié)轉錄和蛋白質水平干擾CBF冷響應途徑。這些發(fā)現(xiàn)表明，順式調控區(qū)域的多態(tài)性對作物進化過程中染色質結構和基因表達具有重要影響，進而影響了番茄的耐寒性。
主要研究結果WRKY34在番茄響應冷脅迫中具有潛在作用：通過對栽培番茄（Ailsa Craig，AC）和野生多毛番茄LA1777進行ATAC-Seq和RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)WRKY34在冷脅迫下的表達和染色質可及性在栽培番茄和野生多毛番茄中存在顯著差異，推測其可能在調節(jié)番茄耐寒性中發(fā)揮潛在作用。
圖1 冷脅迫后栽培番茄和野生番茄中ATAC-Seq和RNA-Seq的聯(lián)合分析結果，以及WRKY34的表達模式和蛋白質積累差異。
WRKY34負向調節(jié)番茄的耐寒性：在LA4024、LA3942和LA1777中沉默SlWRKY34和ShWRKY34后，含有ShWRKY34基因的LA3942和LA1777的非沉默（TRV）幼苗比含有SlWRKY34基因的LA4024的TRV幼苗更耐寒，沉默ShWRKY34后仍保持較強的耐寒性，沉默SlWRKY34后LA4024的耐寒性顯著增強；過表達SlWRKY34和ShWRKY34會降低幼苗的耐寒性，敲除WRKY34會提高耐寒性，且WRKY34會抑制冷響應基因CBFs和CORs的表達。
圖2 栽培番茄和野生番茄中WRKY34等位基因響應冷脅迫的功能鑒定。
WRKY34啟動子區(qū)域的60bp InDel導致其在冷脅迫下的表達模式不同：通過比較不同番茄種質中WRKY34的蛋白質序列，發(fā)現(xiàn)其在冷脅迫下的表達模式差異而非蛋白質功能差異決定了野生番茄和栽培番茄耐寒性的差異；對SlWRKY34和ShWRKY34的啟動子進行擴增和測序，發(fā)現(xiàn)野生番茄中存在60bp的插入，而栽培番茄中不存在，且該插入與WRKY34在冷脅迫下的表達抑制顯著相關。
圖3 WRKY34啟動子中的60bp插入/缺失（InDel）導致WRKY34在冷應激下的不同表達模式。
SWIBs和GATA29直接結合到WRKY34啟動子的60bp InDel片段：通過酵母單雜交（Y1H）篩選，發(fā)現(xiàn)GATA家族轉錄因子SlGATA29和兩個SWIB/MDM2結構域蛋白SlSWIBa和SlSWIBb能夠結合60bp InDel區(qū)域；SlGATA29和SlSWIBa/b通過與該區(qū)域結合抑制WRKY34的表達，且SlSWIBs和GATA29能夠協(xié)同抑制WRKY34的表達。
圖4 SlGATA29 和SlSWIBa/b 在冷脅迫下直接與 WRKY34 啟動子的60 個堿基對的插入/缺失（InDel）結合并抑制 WRKY34 表達。
圖5 SlSWIBa/b 和SlGATA29 協(xié)同抑制 WRKY34 表達
SWIB和GATA29通過60bp InDel影響染色質可及性和耐寒性：在LA4024或LA3942背景下構建SlSWIBb過表達株系和slswibab雙突變體，發(fā)現(xiàn)SWIBs能夠增強WRKY34啟動子的染色質開放，從而提高番茄的耐寒性；構建SlGATA29過表達株系和slgata29突變體，發(fā)現(xiàn)GATA29也能夠抑制WRKY34的表達，從而影響番茄的耐寒性；通過CRISPR/Cas9刪除LA3942中ShWRKY34啟動子的60bp，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的染色質可及性減弱，WRKY34的表達抑制被消除，且植物對冷脅迫更敏感。
圖6 SlSWIBa/b增強了WRKY34啟動子的染色質開放以提高番茄的耐寒性，這取決于 60 個堿基對的插入/缺失（InDel）。
WRKY34在轉錄和蛋白質水平上破壞CBF-COR冷響應途徑：SlWRKY34能夠與SlCBF1相互作用，干擾其轉錄功能，從而降低番茄幼苗的耐寒性；WRKY34還能夠直接結合CBFs和CORs的啟動子，抑制它們的表達。
圖7 SlWRKY34 干擾了SlCBF1 的轉錄活性，從而降低了番茄幼苗的耐寒性。
圖8 WRKY34 介導的番茄耐寒性模型
本研究揭示了番茄耐寒性的分子機制，為作物改良提供了理論依據(jù)，拓展了對基因調控的認識，強調了基因編輯技術在作物育種中的應用潛力，對指導作物改良和育種具有重要意義。
參考文獻Guo, M., Yang, F., Zhu, L., et al. Loss of cold tolerance is conferred by absence of the WRKY34 promoter fragment during tomato evolution[J]. Nature Communications, 2024, 15, 6667.
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