MeRIP-seq等揭示m6A甲基化及調(diào)控因子在食管胃結(jié)合部腺癌中的作用
食管胃結(jié)合部腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction，AEG)是一種在食管胃結(jié)合部發(fā)生的腺癌，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，但具體的發(fā)病機制尚不明確。盡管在基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組水平上對大量AEG患者進行了深入研究，但AEG仍然缺乏有效的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物。因此，理解AEG癌變的分子機制并識別潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點是至關(guān)重要的。N6-甲基腺苷（m6A）修飾及其調(diào)控因子在人類癌癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但它們在食管胃結(jié)合部腺癌（AEG）中的功能和調(diào)控機制仍不清楚。
2024年08月06日，廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）普外科李勇教授研究團隊和東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院高山教授研究團隊合作在《Int J Biol Sci》雜志發(fā)表題為“m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle“的研究論文，研究納入30名新診斷的AEG患者，收集其手術(shù)后的新鮮樣本后通過RNA-seq、RIP/meRIP-seq、 LACE-seq等分析揭示了m6A修飾增強CDC25A穩(wěn)定性，進而通過細(xì)胞周期促進食管胃結(jié)合部腺癌（AEG）的致瘤性。
標(biāo)題：m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle（m6A修飾增強CDC25A穩(wěn)定性，進而通過細(xì)胞周期促進AEG致瘤性）
期刊：International Journal of Biological Sciences（Int J Biol Sci）
影響因子：IF 8.2
技術(shù)平臺：RNA-seq、RIP/meRIP-seq（易基因優(yōu)勢技術(shù)）、 LACE-seq等
本研究從大量AEG患者的m6A調(diào)控因子表達譜中發(fā)現(xiàn)，與配對的正常鄰近組織相比，IGF2BP3是AEG腫瘤中蛋白表達上調(diào)最顯著的m6A調(diào)控因子。沉默IGF2BP3可以在在體外和體內(nèi)抑制AEG進展。通過對AEG中IGF2BP3的全轉(zhuǎn)錄組靶標(biāo)和m6A甲基化組分析結(jié)果表明，IGF2BP3介導(dǎo)的m6A修飾靶點的穩(wěn)定性和表達增強，包括細(xì)胞周期通路靶點，如CDC25A、CDK4和E2F1，對AEG進展至關(guān)重要。從機制上講，CDC25A的m6A修飾增加加速了G1-S期的轉(zhuǎn)換。臨床上IGF2BP3、METTL3和CDC25A在TCGA泛癌細(xì)胞（包括AEG）中的表達上調(diào)表現(xiàn)出強正相關(guān)�？傊狙芯繌娬{(diào)了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在調(diào)控AEG腫瘤進展中的作用，并闡明了m6A/IGF2BP3/CDC25A軸在AEG細(xì)胞中的功能重要性。
研究方法：
結(jié)果圖形
（1）IGF2BP3表達上調(diào)與AEG患者預(yù)后不良相關(guān)
圖1：IGF2BP3表達上調(diào)與AEG患者預(yù)后不良相關(guān)。
(A-B) 83個AEG腫瘤相對于鄰近正常組織(m6A調(diào)節(jié)因子(A)和IGF2BPs(B)的差異表達分析(PRJNA788008))。
(C-E) 83名AEG患者IGF2BPs的ROC分析(C-D)。
(F-G) 5對AEG腫瘤(T)及鄰近正常組織(N)中IGF2BP3的mRNA和蛋白表達水平(n = 5)。
(H) TCGA數(shù)據(jù)集中23種癌癥類型中IGF2BP3 mRNA水平差異分析。
(I) HPA數(shù)據(jù)集中16種癌癥類型中IGF2BP3蛋白的表達水平。
(J-K) Kaplan-Meier生存分析顯示AEG患者和TCGA泛癌中IGF2BP3 mRNA表達水平低和高的整體生存率。
（2）IGF2BP3在AEG中的致癌作用
(C-D) IGF2BP3-KD OE-19 (C) 和 SK-GT4 (D) 細(xì)胞在未涂層Transwell實驗中的定量分析（左）和代表性顯微照片（右）。
(E-F) IGF2BP3-KD OE-19 (E) 和 SK-GT4 (F) 細(xì)胞集落形成實驗中的定量分析（左）和代表性圖像（右）。
(G-I) IGF2BP3-KD OE-19細(xì)胞對裸鼠( n = 6)腫瘤大小(G)、腫瘤生長(H)和質(zhì)量(I)的影響。
(J) KEGG分析顯示IGF2BP3 KD OE-19細(xì)胞中下調(diào)基因的前20個顯著富集通路。
(K-L) 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示IGF2BP3-KD OE-19 (K) 和 SK-GT4 (L) 細(xì)胞在sub-G0-G1期、S期和G2-M期細(xì)胞周期階段的百分比(n = 3)。顯示代表性的細(xì)胞周期圖譜（左）和定量分析（右）。
（3）IGF2BP3 KD全局下調(diào)靶基因表達
(B) 使用meRIP-seq、RIP-seq和LACE-seq數(shù)據(jù)進行HOMER motif分析檢測到的IGF2BP3結(jié)合位點和m6A motif的頂部共有序列。
(C) 餅圖顯示含有m6A peaks的IGF2BP3高置信度靶基因的數(shù)量和百分比。
(D) RIP-seq、LACE-seq和meRIP-seq中各種RNA類型百分比。
(E) Metagene分析顯示IGF2BP3結(jié)合位點和m6A修飾在mRNA轉(zhuǎn)錄組中的富集情況。
(F) 不同基因區(qū)域內(nèi)IGF2BP3結(jié)合峰和m6A peaks分布。
(G-H) IGF2BP3 KD后，非靶基因、IGF2BP3高置信度靶基因 (G) 以及帶有或不帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因 (H) 的mRNA log2FC的累積頻率。
(I-J) KEGG分析顯示帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因的前20個顯著富集通路 (I) 以及帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因和IGF2BP3 KD中下調(diào)基因的重疊基因 (J)。
（4）IGF2BP3以m6A依賴性方式穩(wěn)定CDC25A轉(zhuǎn)錄本
(B) IGF2BP3 KD OE-19和SK-GT4細(xì)胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(C-D) IGF2BP3 KD (C) 和IGF2BP3過表達 (OE) (D) OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細(xì)胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(E) METTL3 KD OE-19和SK-GT4細(xì)胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(F-G) METTL3 KD (F) 和METTL3 OE (G) OE-19和SK-GT4細(xì)胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(H-I) 在IGF2BP3 (H) 或METTL3 (I) KD OE-19細(xì)胞中，用5μM放線菌素D（actinomycin D）處理指定時間后CDC25A的半衰期。
（5）CDC25A m6A位點鑒定
(B) m6A RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾富集。
(C) RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的IGF2BP3富集。 (D) CLIP-seq數(shù)據(jù)集揭示CDC25A 3' UTR中的m6A修飾位點。
(E) qPCR的閾值周期（Ct）顯示METTL3 KD OE-19細(xì)胞中CDC25A的A2131、A2142和A2164位點的SELECT結(jié)果。
(F) 有或沒有m6A CDC25A 3' UTR探針在OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細(xì)胞中RNA下拉結(jié)果中IGF2BP3富集免疫印跡分析。
（6）IGF2BP3通過其3'UTR中的三個m6A位點增加CDC25A表達
(B和C) 雙熒光素酶檢測顯示IGF2BP3或METTL3 KD 293T細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的熒光素酶活性。(E) 293T細(xì)胞用5μM放線菌素D處理指定時間后，耦聯(lián)3'UTR野生型和突變型F-Luc半衰期。
(F) 雙熒光素酶檢測顯示293T細(xì)胞中CDC25A 3' UTR野生型和突變型的熒光素酶活性。
(G-H) RIP-qPCR顯示轉(zhuǎn)染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統(tǒng)的OE-19細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾(G)和IGF2BP3(H)的富集。
(I-J) 轉(zhuǎn)染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統(tǒng)的OE-19細(xì)胞中CDC25A mRNA(I)和蛋白(J)表達的qRT-PCR和免疫印跡分析。
參考文獻：
Pan Y, Feng H, Zhou J, Zhang W, Liu Y, Zheng J, Wang J, Gao S, Li Y. m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle. Int J Biol Sci. 2024;20(11):4209-4221. pii: ijbsv20p4209. doi: 10.7150/ijbs.98535. PubMed PMID: 39247830.
2024年08月06日，廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）普外科李勇教授研究團隊和東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院高山教授研究團隊合作在《Int J Biol Sci》雜志發(fā)表題為“m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle“的研究論文，研究納入30名新診斷的AEG患者，收集其手術(shù)后的新鮮樣本后通過RNA-seq、RIP/meRIP-seq、 LACE-seq等分析揭示了m6A修飾增強CDC25A穩(wěn)定性，進而通過細(xì)胞周期促進食管胃結(jié)合部腺癌（AEG）的致瘤性。
標(biāo)題：m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle（m6A修飾增強CDC25A穩(wěn)定性，進而通過細(xì)胞周期促進AEG致瘤性）
期刊：International Journal of Biological Sciences（Int J Biol Sci）
影響因子：IF 8.2
技術(shù)平臺：RNA-seq、RIP/meRIP-seq（易基因優(yōu)勢技術(shù)）、 LACE-seq等
本研究從大量AEG患者的m6A調(diào)控因子表達譜中發(fā)現(xiàn)，與配對的正常鄰近組織相比，IGF2BP3是AEG腫瘤中蛋白表達上調(diào)最顯著的m6A調(diào)控因子。沉默IGF2BP3可以在在體外和體內(nèi)抑制AEG進展。通過對AEG中IGF2BP3的全轉(zhuǎn)錄組靶標(biāo)和m6A甲基化組分析結(jié)果表明，IGF2BP3介導(dǎo)的m6A修飾靶點的穩(wěn)定性和表達增強，包括細(xì)胞周期通路靶點，如CDC25A、CDK4和E2F1，對AEG進展至關(guān)重要。從機制上講，CDC25A的m6A修飾增加加速了G1-S期的轉(zhuǎn)換。臨床上IGF2BP3、METTL3和CDC25A在TCGA泛癌細(xì)胞（包括AEG）中的表達上調(diào)表現(xiàn)出強正相關(guān)�？傊狙芯繌娬{(diào)了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在調(diào)控AEG腫瘤進展中的作用，并闡明了m6A/IGF2BP3/CDC25A軸在AEG細(xì)胞中的功能重要性。
研究方法：
- 納入30名新診斷AEG患者，收集了手術(shù)后的新鮮樣本。
- 使用人AEG細(xì)胞系進行細(xì)胞培養(yǎng)，并進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
- qRT-PCR、免疫印跡等方法分析基因和蛋白表達。
- 細(xì)胞增殖、遷移、集落形成實驗、熒光素酶報告基因檢測等功能性實驗。
- RNA-seq、RIP/meRIP-seq、LACE-seq等測序分析。
- 裸鼠模型的體內(nèi)實驗評估IGF2BP3 KD或CDC25A過表達對腫瘤形成和生長的影響。
結(jié)果圖形
（1）IGF2BP3表達上調(diào)與AEG患者預(yù)后不良相關(guān)
圖1：IGF2BP3表達上調(diào)與AEG患者預(yù)后不良相關(guān)。
(C-E) 83名AEG患者IGF2BPs的ROC分析(C-D)。
(F-G) 5對AEG腫瘤(T)及鄰近正常組織(N)中IGF2BP3的mRNA和蛋白表達水平(n = 5)。
(H) TCGA數(shù)據(jù)集中23種癌癥類型中IGF2BP3 mRNA水平差異分析。
(I) HPA數(shù)據(jù)集中16種癌癥類型中IGF2BP3蛋白的表達水平。
(J-K) Kaplan-Meier生存分析顯示AEG患者和TCGA泛癌中IGF2BP3 mRNA表達水平低和高的整體生存率。
（2）IGF2BP3在AEG中的致癌作用
圖2：IGF2BP3在AEG中發(fā)揮致癌作用。
(A-B) 評估IGF2BP3敲低（KD）OE-19 (A) 和 SK-GT4 (B) 細(xì)胞的細(xì)胞增殖實驗。(C-D) IGF2BP3-KD OE-19 (C) 和 SK-GT4 (D) 細(xì)胞在未涂層Transwell實驗中的定量分析（左）和代表性顯微照片（右）。
(E-F) IGF2BP3-KD OE-19 (E) 和 SK-GT4 (F) 細(xì)胞集落形成實驗中的定量分析（左）和代表性圖像（右）。
(G-I) IGF2BP3-KD OE-19細(xì)胞對裸鼠( n = 6)腫瘤大小(G)、腫瘤生長(H)和質(zhì)量(I)的影響。
(J) KEGG分析顯示IGF2BP3 KD OE-19細(xì)胞中下調(diào)基因的前20個顯著富集通路。
(K-L) 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示IGF2BP3-KD OE-19 (K) 和 SK-GT4 (L) 細(xì)胞在sub-G0-G1期、S期和G2-M期細(xì)胞周期階段的百分比(n = 3)。顯示代表性的細(xì)胞周期圖譜（左）和定量分析（右）。
（3）IGF2BP3 KD全局下調(diào)靶基因表達
圖3：IGF2BP3 KD 全局下調(diào)靶基因表達。
(A) 在OE-19細(xì)胞中通過RIP-seq和LACE-seq鑒定IGF2BP3靶基因的重疊。(B) 使用meRIP-seq、RIP-seq和LACE-seq數(shù)據(jù)進行HOMER motif分析檢測到的IGF2BP3結(jié)合位點和m6A motif的頂部共有序列。
(C) 餅圖顯示含有m6A peaks的IGF2BP3高置信度靶基因的數(shù)量和百分比。
(D) RIP-seq、LACE-seq和meRIP-seq中各種RNA類型百分比。
(E) Metagene分析顯示IGF2BP3結(jié)合位點和m6A修飾在mRNA轉(zhuǎn)錄組中的富集情況。
(F) 不同基因區(qū)域內(nèi)IGF2BP3結(jié)合峰和m6A peaks分布。
(G-H) IGF2BP3 KD后，非靶基因、IGF2BP3高置信度靶基因 (G) 以及帶有或不帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因 (H) 的mRNA log2FC的累積頻率。
(I-J) KEGG分析顯示帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因的前20個顯著富集通路 (I) 以及帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因和IGF2BP3 KD中下調(diào)基因的重疊基因 (J)。
（4）IGF2BP3以m6A依賴性方式穩(wěn)定CDC25A轉(zhuǎn)錄本
圖4：IGF2BP3以m6A依賴性方式穩(wěn)定CDC25A轉(zhuǎn)錄本。
(A) 在IGF2BP3 KD后，以m6A依賴性方式結(jié)合IGF2BP3的細(xì)胞周期相關(guān)基因的差異表達分析。(B) IGF2BP3 KD OE-19和SK-GT4細(xì)胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(C-D) IGF2BP3 KD (C) 和IGF2BP3過表達 (OE) (D) OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細(xì)胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(E) METTL3 KD OE-19和SK-GT4細(xì)胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(F-G) METTL3 KD (F) 和METTL3 OE (G) OE-19和SK-GT4細(xì)胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(H-I) 在IGF2BP3 (H) 或METTL3 (I) KD OE-19細(xì)胞中，用5μM放線菌素D（actinomycin D）處理指定時間后CDC25A的半衰期。
（5）CDC25A m6A位點鑒定
圖5：鑒定CDC25A的m6A位點。
(A) 基于meRIP-seq、IGF2BP3 RIP-seq和LACE-seq數(shù)據(jù)（n=2）的CDC25A轉(zhuǎn)錄本峰值分布。(B) m6A RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾富集。
(C) RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的IGF2BP3富集。 (D) CLIP-seq數(shù)據(jù)集揭示CDC25A 3' UTR中的m6A修飾位點。
(E) qPCR的閾值周期（Ct）顯示METTL3 KD OE-19細(xì)胞中CDC25A的A2131、A2142和A2164位點的SELECT結(jié)果。
(F) 有或沒有m6A CDC25A 3' UTR探針在OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細(xì)胞中RNA下拉結(jié)果中IGF2BP3富集免疫印跡分析。
（6）IGF2BP3通過其3'UTR中的三個m6A位點增加CDC25A表達
圖6：IGF2BP3通過其3' UTR中的三個m6A位點增加CDC25A表達。
(A和D) 在IGF2BP3和METTL3 KD 293T細(xì)胞中，用5μM放線菌素D處理指定時間后，耦聯(lián)3'UTR野生型(A)和突變型(D)F-Luc半衰期。(B和C) 雙熒光素酶檢測顯示IGF2BP3或METTL3 KD 293T細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的熒光素酶活性。(E) 293T細(xì)胞用5μM放線菌素D處理指定時間后，耦聯(lián)3'UTR野生型和突變型F-Luc半衰期。
(F) 雙熒光素酶檢測顯示293T細(xì)胞中CDC25A 3' UTR野生型和突變型的熒光素酶活性。
(G-H) RIP-qPCR顯示轉(zhuǎn)染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統(tǒng)的OE-19細(xì)胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾(G)和IGF2BP3(H)的富集。
(I-J) 轉(zhuǎn)染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統(tǒng)的OE-19細(xì)胞中CDC25A mRNA(I)和蛋白(J)表達的qRT-PCR和免疫印跡分析。
參考文獻：
Pan Y, Feng H, Zhou J, Zhang W, Liu Y, Zheng J, Wang J, Gao S, Li Y. m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle. Int J Biol Sci. 2024;20(11):4209-4221. pii: ijbsv20p4209. doi: 10.7150/ijbs.98535. PubMed PMID: 39247830.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
- 靶基因甲基化測序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
- ChIP等揭示糖皮質(zhì)激素和TET2共調(diào)控促進癌癥轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機制
- 游離細(xì)胞DNA（cfDNA）檢測整體研究方案及其應(yīng)用案例
- DNA甲基化修飾整體研究方案技術(shù)介紹及經(jīng)典案例分析
- DNA甲基化詳解
- 逆轉(zhuǎn)衰老！飲食、運動改變DNA甲基化
- DNA與蛋白質(zhì)互作及染色質(zhì)開放性研究方案應(yīng)用案例匯總
- 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示錳離子在腫瘤NK細(xì)胞功能調(diào)控中的角色
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