在神經(jīng)科學研究中，深入了解大腦的活動機制一直是科學家們的追求目標。傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡在成像時存在一些局限性，例如采樣速度、空間分辨率和視場之間的權衡，以及單光束掃描策略導致的成像通量限制和盲掃描策略帶來的低效和熱損傷問題。

為了解決這些問題，研究團隊一直在探索新的自適應采樣策略。

近日，加州大學戴維斯分校的研究團隊研發(fā)出一種新型的雙光子熒光顯微鏡，為高速大腦成像帶來了新的突破。

原理與特點

研究團隊的顯微鏡使用了自適應線激發(fā)的采樣方案，其工作原理是用動態(tài)圖案匹配神經(jīng)元細胞體局部結構的短線照射腦組織。通過數(shù)字微鏡設備（DMD）對激發(fā)線進行空間調(diào)制，使其只捕獲圖像平面中的感興趣區(qū)域（ROI，即神經(jīng)元細胞體）而非背景區(qū)域。

DMD在這個過程中起到了關鍵作用，它作為強度調(diào)制器，加載與神經(jīng)元細胞體形態(tài)匹配的二進制掩模，位于樣本平面的共軛平面。飛秒激光（920nm）先被整形為線，通過諧振掃描儀（8kHz）和振鏡掃描到DMD上，DMD反射的光攜帶ROI的相關信息，通過中繼系統(tǒng)、管透鏡和物鏡光學中繼到樣本平面以成像腦組織。

這種自適應線激發(fā)方案具有多個顯著特點。首先，它單次測量采樣區(qū)域更大，減少了成像中的行數(shù)，從而提高了幀率。例如，在實驗中，他們將激發(fā)線的長度在樣本平面上塑造為約11.5μm（1/e²），與小鼠大腦中神經(jīng)元細胞體的直徑相似（10-15μm）。這樣既能保證快速成像速度，又能保持細胞分辨率，避免相鄰神經(jīng)元之間的過度信號串擾。

同時，該方法還對圖像進行了有效的預處理，將盲采樣方法記錄的圖像中的像素進行凝聚，大多屬于單個源，減少了數(shù)據(jù)量和后續(xù)數(shù)據(jù)處理（分割和提取時間活動軌跡）的計算時間。

其次，該方案能獨家采樣神經(jīng)元細胞體，避免背景區(qū)域的不必要激發(fā)，從而大大降低了輸送到腦組織的總激光功率和熱損傷。盡管激發(fā)線�。�2.0μm，半高全寬，F(xiàn)WHM），軸向PSF的FWHM約為16.5μm，但在保持細胞分辨率的同時有效地避免了相鄰神經(jīng)元之間的過度信號串擾。

實驗設置和結果

為了驗證該方案的有效性，研究團隊進行了一系列實驗。在模擬實驗中，研究團隊在模擬鈣成像數(shù)據(jù)集中模擬了自適應線激發(fā)采樣過程。結果表明，CalmAn（一種約束非負矩陣分解算法）成功分割了神經(jīng)元的空間足跡，提取的時間軌跡與地面實況具有高皮爾遜相關系數(shù)，神經(jīng)元信號通常可以從空間重疊的神經(jīng)元中分離出來。這說明自適應線采樣記錄保留了與原始高分辨率記錄相同的信息，且計算資源需求顯著降低。

在驗證實驗中，通過熒光幻影樣本驗證了DMD的光束圖案能力和自適應采樣的概念。實驗結果表明，圖像記錄與二進制掩模匹配良好，驗證了DMD與樣本平面的共軛關系以及與樣本結構的良好對齊，進一步驗證了DMD與樣本結構之間強大的映射關系。

在活體實驗中，研究團隊在活體清醒小鼠中進行實驗，小鼠初級視覺皮層（V1）的2/3層轉染了鈣指示劑GCaMP6f。

實驗結果顯示，采樣策略減少了諧振掃描儀掃描的行數(shù)，從而將幀率提高到198Hz（FOV為500μm×695μm），顯著高于傳統(tǒng)雙光子顯微鏡；使用自適應采樣策略時，激光功率顯著降低（比無自適應采樣時小約14倍），平均激光功率僅為約1.5mW，避免了對小鼠大腦的熱損傷；同時，成功提取了單個ROI的時間活動軌跡，并在深度為450μm的皮層中成功提取了91個ROI。

此外，該方法還具有良好的兼容性和可擴展性。它與許多其他光束復用技術兼容，可進一步提高成像通量。通過適當設置和循環(huán)DMD模式，顯微鏡在不物理修改光學設置的情況下，保留了等效點掃描高分辨率成像的能力。

不過，當前的點擴散函數(shù)（PSF）可能導致成像神經(jīng)元細胞體時出現(xiàn)離焦背景，未來可以通過進一步收緊光束的軸向范圍或使用矩陣分解算法捕獲細胞體附近的背景信號并將其去除來優(yōu)化。

與其他類似線掃描策略相比，該方法避免了在成像深度、計算資源或系統(tǒng)設置方面的挑戰(zhàn)。與SLAP2相比，有效插入損耗較低，可使用更常見和成本效益更高的80MHz飛秒激光。

總結與展望

總的來說，這種新型的雙光子顯微鏡具有硬件簡單、不需要調(diào)制器和掃描儀同步等優(yōu)勢，同時通過結合光束復用技術和使用更快的諧振掃描儀，成像速度可達到千赫茲，適用于電壓成像，也可用于三維/體積成像和成像具有更精細特征的ROI，如樹突和棘突。

這項研究為神經(jīng)科學研究提供了一種強大的工具，有助于我們更深入地了解大腦的活動機制。期待未來能有更多的研究成果基于此技術展開，為人類健康和科學發(fā)展帶來更多的福祉。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于:Yunyang Li,Shu Guo,Ben Mattison,Junjie Hu,Kwun Nok Mimi Man,and Weijian Yang, "High-speed two-photon microscopy with adaptive line-excitation,"Optica 11,1138-1145(2024)