近年來，小核酸藥物研發(fā)和臨床治療取得了多項(xiàng)突破性成果，已成為全球投資新風(fēng)口和生物制藥巨頭的必爭(zhēng)之地，核酸療法進(jìn)入快車道。核酸適配體藥物作為核酸療法的重要組成部分，具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域有著廣闊的市場(chǎng)前景。

一、核酸適配體藥物介紹

核酸適配體（Aptamer）是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）得到的一段長(zhǎng)度在20～100 nt左右的單鏈DNA或RNA序列，可以作為靶向性治療的分子探針。SELEX技術(shù)的初始文庫(kù)是單鏈DNA或RNA文庫(kù)，由1014~1016個(gè)隨機(jī)的長(zhǎng)度為20～100個(gè)核苷酸序列的寡核苷酸組成，兩端為固定引物序列，中間有一個(gè)隨機(jī)區(qū)域。初始文庫(kù)與靶標(biāo)物質(zhì)孵育后，結(jié)合的寡核苷酸從未結(jié)合序列中分離并通過PCR擴(kuò)增，得到的富集池投入下一輪的篩選，不斷循環(huán)最終找到高親和力適配體。(圖1）
核酸適配體可折疊形成發(fā)卡（hairpin）、假結(jié)（pseudoknot) 、凸環(huán)（bulge）、G-四聚體（G-quadruplex）等穩(wěn)定的二級(jí)和三級(jí)空間結(jié)構(gòu)。核酸適配體的這些空間構(gòu)型能夠與靶標(biāo)物質(zhì)通過靜電作用、氫鍵作用、堆積作用、疏水作用和形狀匹配等多種相互作用力形成嵌合或包被的高親和力復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的高度特異性識(shí)別結(jié)合。（圖2）
 
核酸適配體能夠識(shí)別、結(jié)合的靶標(biāo)物質(zhì)范圍非常廣泛，包括金屬離子、小分子、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子，甚至是完整的細(xì)胞、病毒等。核酸適配體具有與抗體相當(dāng)?shù)挠H和力，其親和常數(shù)可達(dá)納摩爾或皮摩爾水平，因此被稱為“化學(xué)抗體”。然而同抗體相比核酸適配體具有更大的優(yōu)勢(shì)，其中包括具有更好的組織穿透性、更高的熱穩(wěn)定性、更低的免疫原性、更易生產(chǎn)以及可以在不喪失活性的情況下在適配體的天然寡核苷酸骨架中引入各種化學(xué)修飾等。表1所示為核酸適配體和抗體的對(duì)比情況。

表1  核酸適配體和抗體對(duì)比
 

Criteria	Aptamers	Antibody
Basic composition	Nucleotide (four members: A, G, T/U and C)	Amino acid (20 members)
Materials	Nucleic acid (single-stranded DNA or RNA)	• Protein (polymer peptide) •Antibodies consist of two light chains and two heavy chains
Molecular weight and/or size	• 6–30kDa (20–100nt) • ~2nm	• 150–180kDa • ~15nm
Secondary structure	•Hairpin, stem, loop, bulge, G-quadruplex or kissing complex	• α-Helix and β-fold
Binding pattern and/or mechanism of action	• Surface recognition • Three-dimensional interactions via van der Waals forces, hydrogen bonding and electrostatic interactions similar to the way antibodies bind to antigen • Reversal of activity via complementary antidote oligonuclotides	• Binding pocket (key and lock model) • Three-dimensional interaction; antibodies recognize epitopes located on the target antigen
Affinity	•High • Multivalent aptamers can confer increasing affinity and additional functions	•High •Affinity between antibody and antigen depends on the number of identical epitopes on the target antigen
Specificity	•High • The aptamer is able to identify single point mutations and conformational isomers	•High •Antigens may have multiple epitopes, which allow different antibodies to bind to the same antigen
Potential targets	•Wide range: ions, organic and inorganic molecules, nucleic acids, peptides, proteins, toxins, viral particles, whole cells, entire organs and live animals	• Limited to immunogenic molecules •No toxins or other molecules that do not cause strong immune responses
Generation and discovery	• In vitro SELEX (2–15 selection rounds) • ~2–8 weeks •Aptamer can be selected in hours or days via high-throughput automated SELEX	• In vivo biological system • ~6 months or longer
Manufacturing and costs	•Chemical solid-phase synthesis •Controllable and completely in vitro procedure • 2 days for milligrams; 2 weeks for grams •No or low risk of contamination • Facile regulatory affairs and cGMP • Low cost for DNA; high cost for long RNA (>60nt) with special modifications •Costs lowered with the development of new technology	• In vivo (animal-based production) • Potential contamination due to cells or animal-based production • 3 months for 5–20 grams • From mammalian cells: high cost • From transgenic plants or animals: low cost
Batch-to-batch variation	•None or low	• Significant
Physical and thermal stability	•Very stable and long shelf-life • Resistant to high temperature (even up to 95°C) and cycles of denaturation and renaturation •Aptamers can be lyophilized for long-term storage and transport at room temperature	•Unstable and limited shelf-life • Susceptible to temperature (even at room temperature or 37°C) and irreversible denaturation • Requires refrigeration for storage and transport
Chemical modification and conjugation	•Convenient and controllable •Various types available, including sugar, backbone, base and other modifications •Aptamers can be rationally modified without loss of binding affinity	• Restricted and uncontrollable • Limited types and chemical reactions • Stochastic modifications very likely to cause negative consequences, such as loss of activity
Tissue uptake and penetration	• Faster	• Slower
Immunogenicity	•None or low immunogenicity	•High immunogenicity • Increased immune reaction with repeated dosing
Nuclease degradation	•Vulnerable • Limited half-life in vivo (~10min for unmodified version)	• Resistant and not affected by nucleases in vivo
Kidney filtration	• Faster • Short circulation time in vivo (~30min for unconjugated version)	• Slower • Long circulation time (up to 1 month)
Patents and distribution	• Exclusive patents in SELEX technology • Limited initial distribution	• Expired protection or no early patents • More widespread distribution
Development and market	• The development pathway is less explored • Insufficient education and investment (R&D support) •Commercialization has focused on diagnostic-based aptamer products	•Well-developed infrastructure •Abundant support from finance and education • Rapid and sustained increase in drug market share

cGMP, current good manufacturing practice; nt, nucleotide; SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment.

來源：Aptamers as targeted therapeutics: current potential and challenges

憑借其諸多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，核酸適配體在藥物研發(fā)領(lǐng)域發(fā)展前景廣闊。美國(guó) FDA 在 2004年通過了第一個(gè)用于治療年齡相關(guān)的黃斑變性的核酸適配體藥物哌加他尼鈉 ( pegaptanib sodium，商品名為Macugen) ，將核酸適配體藥物的研發(fā)推向一個(gè)新的高度。現(xiàn)已有11種核酸適配體藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段（表2），未來必定會(huì)有更多的核酸適配體藥物被研發(fā)出來，并最終用于治療疾病。

表2  進(jìn)入臨床階段的核酸適配體藥物
 

藥物名稱	性質(zhì)	靶標(biāo)	治療疾病	臨床階段	時(shí)間	研究單位
Pegaptanib	RNA	VEGF	AMD	上市（現(xiàn)已退市）	2004	Eyetech/Pfizer公司
Zimura	RNA	C5	AMD	Ⅰ期	2016	Ophthotech公司
Fovista	DNA	PDGF	AMD	Ⅲ期	2016	Ophthotech公司
AS1411	DNA	核仁蛋白	腎癌	Ⅱ期	2008	Antisoma研究中心
NOX-A12	RNA	CXCL12	CLL	Ⅰ期	2012	NOXXON制藥公司
NOX-E36	RNA	CCL2	DN	Ⅰ期	2015	NOXXON制藥公司
ARC1779	DNA	VWF	TTP	Ⅱ期	2008	Archemix公司
ARC19499	RNA	TFPI	血友病	Ⅰ期	2010	維也納醫(yī)科大學(xué)
NU172	DNA	凝血酶	心臟病	Ⅱ期	2013	ARCA生物制藥公司
REG1	RNA	FIXa	冠狀動(dòng)脈疾病	Ⅱ期	2007	Regado生物科學(xué)公司
NOX-H94	RNA	鐵調(diào)素	ACI	Ⅱ期	2013	NOXXON制藥公司

數(shù)據(jù)來源：核酸適配體藥物的研究進(jìn)展

二、核酸適配體藥物體外代謝研究策略

和傳統(tǒng)小分子藥物一樣，在藥物臨床前研究階段，通常需要對(duì)Aptamer藥物進(jìn)行體外代謝研究，并提供代謝途徑及其產(chǎn)物相關(guān)信息。Aptamer藥物的代謝酶主要為核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶，廣泛分布于血液和各個(gè)組織器官，一個(gè)合適的體外代謝研究體系，能夠最大程度地預(yù)測(cè)體內(nèi)的情況，對(duì)于Aptamer藥物的早期篩選非常重要。表3所示為常用的Aptamer藥物體外代謝研究體系。

表3 Aptamer藥物的體外代謝研究體系
 

生物基質(zhì)	試驗(yàn)類型	備注
血清/血漿	代謝穩(wěn)定性，血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)	金屬螯合劑抗凝的血漿不適合代謝穩(wěn)定性研究。
肝S9	代謝穩(wěn)定性，代謝產(chǎn)物鑒定	肝S9一定程度上可以代替肝組織勻漿使用。
肝微粒體	代謝穩(wěn)定性	肝微粒體的核酸酶活性較低，可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。
肝組織勻漿	代謝穩(wěn)定性，代謝產(chǎn)物鑒定	酶體系比較全面，推薦用于Aptamer藥物的體外篩選評(píng)價(jià)。
肝細(xì)胞	代謝穩(wěn)定性，代謝產(chǎn)物鑒定	肝細(xì)胞酶體系最為完善，適用于肝靶向的Aptamer藥物研究。
溶酶體	代謝穩(wěn)定性	溶酶體具有豐富的酶體系，包括核酸酶和各種水解酶等，是研究Aptamer藥物代謝穩(wěn)定性的高效實(shí)驗(yàn)體系。

三、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

為滿足客戶對(duì)于Aptamer藥物體外代謝研究的需求，IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)出來多種用于Aptamer藥物體外代謝研究的產(chǎn)品，助力廣大客戶進(jìn)行Aptamer藥物早期篩選研究。
 

類別	分類
亞細(xì)胞組分	肝溶酶體
	酸化肝勻漿液
	肝/腸/腎/肺S9
	肝/腸/腎/肺微粒體
	肝/腸/腎/肺胞質(zhì)液
原代肝細(xì)胞	懸浮肝細(xì)胞
	貼壁肝細(xì)胞
專屬血漿	血漿穩(wěn)定性
	血漿蛋白結(jié)合

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者來電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。

參考文獻(xiàn)：

[1] Shuanghui Yang, Huan Li, Ling Xu, et al. Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2018, 13, 164-165.

[2] Jiehua Zhou, John Rossi. Aptamers as targeted therapeutics: Current potential and challenges. Nat. Rev. Drug Discovery. 2017, 16(3): 181-202.

[3]   靳貴曉，李娟，楊黃浩. 核酸適體的篩選及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J]．福州大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，44(6):920-934.

[4]   劉珊，肖楠，王睿，等. 核酸適配體藥物的研究進(jìn)展[J]．生命科學(xué)儀器，2020，18:16-24.

匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。