血液Target-BS揭示靶向DNA甲基化標(biāo)記水平與患者乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)
符合遺傳性乳腺癌和卵巢癌（HBOC）標(biāo)準(zhǔn)的患者中，只有不到15-20%攜帶致病性編碼基因突變，意味著可能存在其他分子機(jī)制導(dǎo)致這種疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。外周血DNA甲基化是乳腺癌（BC）風(fēng)險(xiǎn)的潛在表觀遺傳標(biāo)記。在分子水平上，BC 組織中DNA甲基化標(biāo)記變化主要發(fā)生在致癌發(fā)展的早期階段。但當(dāng)前的研究主要集中在有限數(shù)量的基因和HBOC患者上，并沒有在大規(guī)�；騊anel中分析沒有遺傳致病變異的患者DNA甲基化情況。
2024年6月，墨西哥國立自治大學(xué)Iztacala高等研究學(xué)院Felipe Vaca-Paniagua團(tuán)隊(duì)通過靶向亞硫酸鹽測(cè)序（targeted bisulfite sequencing）對(duì)18個(gè)腫瘤抑制基因（抑癌基因）啟動(dòng)子（330個(gè)CpG位點(diǎn)）進(jìn)行甲基化分析。揭示了：① EPCAM（17個(gè)CpG位點(diǎn)；p=0.017）和RAD51C（27個(gè)CpG位點(diǎn)；p=0.048）中的高甲基化；② BC患者中36個(gè)CpG特異性位點(diǎn)的高甲基化（FDR q<0.05）；③ 四個(gè)特定CpG位點(diǎn)與更高BC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（FDR q<0.01, Bonferroni p<0.001）：cg89786999-FANCI（OR=1.65；95% CI:1.2–2.2）、cg23652916-PALB2（OR=2.83；95% CI:1.7–4.7）、cg47630224-MSH2（OR=4.17；95% CI:2.1–8.5）和cg47596828-EPCAM（OR=1.84；95% CI:1.5–2.3）。在澳大利亞的一個(gè)隊(duì)列中對(duì)cg47630224-MSH2甲基化進(jìn)行驗(yàn)證，顯示BC風(fēng)險(xiǎn)增加3倍（AUC: 0.929；95% CI: 0.904–0.955）。表明四個(gè)DNA甲基化CpG位點(diǎn)可能與更高的BC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可能作為未檢測(cè)到編碼突變的患者的生物標(biāo)志物。相關(guān)研究成果以“Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria”發(fā)表在《npj Precision Oncology》（IF 6.8）期刊上。
研究方法：
（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
圖1：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
a. 患者選擇的招募和入選標(biāo)準(zhǔn)
b. Target-BS樣本準(zhǔn)備、亞硫酸鹽處理、靶向啟動(dòng)子和總擴(kuò)增分析
c. DNA文庫制備workflow、條形碼、自動(dòng)化生物信息學(xué)分析和生物統(tǒng)計(jì)分析
（2）高通量DNA甲基化測(cè)序揭示高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌患者抑癌基因中的異常甲基化。
a.分析抑癌基因（TSGs）啟動(dòng)子區(qū)域的位點(diǎn)特異性甲基化狀態(tài)。
b. EPCAM、ATM、RAD51C和POLH中高甲基化CpG位點(diǎn)的差異水平。TSS表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，CGI表示CpG島相對(duì)位點(diǎn)，PC表示陽性對(duì)照，TSGs代表抑癌基因。
（3）乳腺癌患者在四個(gè)特定CpG位點(diǎn)表現(xiàn)出高甲基化富集
b. 330個(gè)特異性CpG位點(diǎn)的PCA分析。cg8978699-FANCI、cg23652916-PALB2、cg47630224-MSH2和cg47596828-EPCAM的差異最大（箭頭所示）。所有EPCAM位點(diǎn)形成了一個(gè)獨(dú)立的組。
c. 各個(gè)CpG位點(diǎn)的差異高甲基化水平。紅點(diǎn)代表顯著位點(diǎn)。
d. 與對(duì)照組相比，顯著CpG位點(diǎn)的差異高甲基化。
圖4：比較患者組與對(duì)照組中PALB2、EPCAM、MSH2和FANCI啟動(dòng)子區(qū)域的位點(diǎn)特異性種系甲基化水平。
a-d. 顯示四個(gè)基因位點(diǎn)。藍(lán)色實(shí)線表示來自血液對(duì)照的平均甲基化值。橙色虛線表示患者平均甲基化值。位點(diǎn)cg47596828-EPCAM、cg47630224-MSH2、cg23652916-PALB2和cg89786999-FANCI在患者中顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的甲基化水平增加�；騾^(qū)域的示意圖表示CpG島和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）。
b. cg23652916-PALB2和cg47630224-MSH2的Z分?jǐn)?shù)共甲基化水平。
（4）四個(gè)特異性高甲基化CpG位點(diǎn)作為乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物
b. 四個(gè)CpG位點(diǎn)的ROC性能。
c. 對(duì)11個(gè)CpG位點(diǎn)組合的靈敏度和特異性進(jìn)行綜合分析。黃色氣泡代表最佳標(biāo)記組合（Se>70%，Sp>60%），稱為“金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記”。
d. 金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記組合7、10和11的生物標(biāo)志物能力。
e. 在三個(gè)國際隊(duì)列中對(duì)cg47630224-MSH2進(jìn)行差異甲基化分析。
f. cg47630224-MSH2位點(diǎn)與三個(gè)隊(duì)列中BC風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析。
g. 所有隊(duì)列中cg47630224-MSH2位點(diǎn)的生物標(biāo)志物能力：澳大利亞（藍(lán)色）、烏拉圭（綠色）、意大利（紅色）。
易小結(jié)
本研究在單個(gè)堿基分辨率下對(duì)大型病例對(duì)照數(shù)據(jù)集中的高風(fēng)險(xiǎn)基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行全面分析，利用健康人群對(duì)照來最小化非遺傳和環(huán)境因素引起的甲基化水平變異。提供了關(guān)于符合HBOC標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者種系甲基化與癌癥易感性基因之間的相關(guān)性證據(jù)（這些患者沒有可檢測(cè)到的編碼致病變異）。研究共鑒定出四個(gè)新的潛在表觀遺傳標(biāo)記，與更高的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這些標(biāo)記在獨(dú)立隊(duì)列中得到了驗(yàn)證�？傮w而言，這項(xiàng)工作有助于提高對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌患者的表觀遺傳譜的理解，這可能是病因?qū)W的其他機(jī)制。進(jìn)一步研究表觀遺傳標(biāo)記有潛力增強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并促進(jìn)乳腺癌管理中的個(gè)性化方法。
圖7：與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的異常甲基化標(biāo)記模型。
參考文獻(xiàn)：
Ruiz-De La Cruz M,et al. Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria. NPJ Precis Oncol. 2024 Jun 19;8(1):136. pii: 10.1038/s41698-024-00611-z. doi: 10.1038/s41698-024-00611-z. PubMed PMID: 38898118.
2024年6月，墨西哥國立自治大學(xué)Iztacala高等研究學(xué)院Felipe Vaca-Paniagua團(tuán)隊(duì)通過靶向亞硫酸鹽測(cè)序（targeted bisulfite sequencing）對(duì)18個(gè)腫瘤抑制基因（抑癌基因）啟動(dòng)子（330個(gè)CpG位點(diǎn)）進(jìn)行甲基化分析。揭示了：① EPCAM（17個(gè)CpG位點(diǎn)；p=0.017）和RAD51C（27個(gè)CpG位點(diǎn)；p=0.048）中的高甲基化；② BC患者中36個(gè)CpG特異性位點(diǎn)的高甲基化（FDR q<0.05）；③ 四個(gè)特定CpG位點(diǎn)與更高BC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（FDR q<0.01, Bonferroni p<0.001）：cg89786999-FANCI（OR=1.65；95% CI:1.2–2.2）、cg23652916-PALB2（OR=2.83；95% CI:1.7–4.7）、cg47630224-MSH2（OR=4.17；95% CI:2.1–8.5）和cg47596828-EPCAM（OR=1.84；95% CI:1.5–2.3）。在澳大利亞的一個(gè)隊(duì)列中對(duì)cg47630224-MSH2甲基化進(jìn)行驗(yàn)證，顯示BC風(fēng)險(xiǎn)增加3倍（AUC: 0.929；95% CI: 0.904–0.955）。表明四個(gè)DNA甲基化CpG位點(diǎn)可能與更高的BC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可能作為未檢測(cè)到編碼突變的患者的生物標(biāo)志物。相關(guān)研究成果以“Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria”發(fā)表在《npj Precision Oncology》（IF 6.8）期刊上。
研究方法：
- 研究對(duì)象包括231名符合HBOC標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者（這些患者未檢測(cè)到編碼致病變異）和156名健康對(duì)照組。
- 通過靶向亞硫酸鹽測(cè)序（targeted bisulfite sequencing，Target-BS）對(duì)18個(gè)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域（330個(gè)CpG位點(diǎn)）進(jìn)行甲基化分析。
- 使用統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)方法分析甲基化數(shù)據(jù)，包括Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、多元邏輯回歸分析、ROC曲線分析等。
- 獨(dú)立隊(duì)列驗(yàn)證。
（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
圖1：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
b. Target-BS樣本準(zhǔn)備、亞硫酸鹽處理、靶向啟動(dòng)子和總擴(kuò)增分析
c. DNA文庫制備workflow、條形碼、自動(dòng)化生物信息學(xué)分析和生物統(tǒng)計(jì)分析
（2）高通量DNA甲基化測(cè)序揭示高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌患者抑癌基因中的異常甲基化。
圖2：乳腺癌抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化CpG位點(diǎn)。
a.分析抑癌基因（TSGs）啟動(dòng)子區(qū)域的位點(diǎn)特異性甲基化狀態(tài)。
b. EPCAM、ATM、RAD51C和POLH中高甲基化CpG位點(diǎn)的差異水平。TSS表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，CGI表示CpG島相對(duì)位點(diǎn)，PC表示陽性對(duì)照，TSGs代表抑癌基因。
（3）乳腺癌患者在四個(gè)特定CpG位點(diǎn)表現(xiàn)出高甲基化富集
圖3：四種異常DNA甲基化標(biāo)記與乳腺癌相關(guān)。
a. 每個(gè)啟動(dòng)子的平均Z分?jǐn)?shù)的主成分分析（PCA）。b. 330個(gè)特異性CpG位點(diǎn)的PCA分析。cg8978699-FANCI、cg23652916-PALB2、cg47630224-MSH2和cg47596828-EPCAM的差異最大（箭頭所示）。所有EPCAM位點(diǎn)形成了一個(gè)獨(dú)立的組。
c. 各個(gè)CpG位點(diǎn)的差異高甲基化水平。紅點(diǎn)代表顯著位點(diǎn)。
d. 與對(duì)照組相比，顯著CpG位點(diǎn)的差異高甲基化。
圖4：比較患者組與對(duì)照組中PALB2、EPCAM、MSH2和FANCI啟動(dòng)子區(qū)域的位點(diǎn)特異性種系甲基化水平。
圖5：cg23652916-PALB2和cg47630224-MSH2位點(diǎn)的共甲基化。
a. 監(jiān)督分層聚類熱圖顯示51名患者中MSH2-PALB2共甲基化亞群。Y軸：CpG位點(diǎn)。X軸：對(duì)照組和患者。下方的條形顯示每個(gè)患者與每個(gè)高甲基化位點(diǎn)相關(guān)的年齡、組織病理學(xué)和分子亞型。DCIS代表導(dǎo)管原位癌，LCIS代表小葉原位癌，IDC代表浸潤性導(dǎo)管癌，ILC代表浸潤性小葉癌，MC代表髓樣癌，PC代表陽性對(duì)照。b. cg23652916-PALB2和cg47630224-MSH2的Z分?jǐn)?shù)共甲基化水平。
（4）四個(gè)特異性高甲基化CpG位點(diǎn)作為乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物
圖6：獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中四個(gè)CpG位點(diǎn)的生物標(biāo)志物潛力以及 cg47630224-MSH2 與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。
a. 四個(gè)高甲基化CpG位點(diǎn)的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。b. 四個(gè)CpG位點(diǎn)的ROC性能。
c. 對(duì)11個(gè)CpG位點(diǎn)組合的靈敏度和特異性進(jìn)行綜合分析。黃色氣泡代表最佳標(biāo)記組合（Se>70%，Sp>60%），稱為“金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記”。
d. 金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記組合7、10和11的生物標(biāo)志物能力。
e. 在三個(gè)國際隊(duì)列中對(duì)cg47630224-MSH2進(jìn)行差異甲基化分析。
f. cg47630224-MSH2位點(diǎn)與三個(gè)隊(duì)列中BC風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析。
g. 所有隊(duì)列中cg47630224-MSH2位點(diǎn)的生物標(biāo)志物能力：澳大利亞（藍(lán)色）、烏拉圭（綠色）、意大利（紅色）。
易小結(jié)
本研究在單個(gè)堿基分辨率下對(duì)大型病例對(duì)照數(shù)據(jù)集中的高風(fēng)險(xiǎn)基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行全面分析，利用健康人群對(duì)照來最小化非遺傳和環(huán)境因素引起的甲基化水平變異。提供了關(guān)于符合HBOC標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者種系甲基化與癌癥易感性基因之間的相關(guān)性證據(jù)（這些患者沒有可檢測(cè)到的編碼致病變異）。研究共鑒定出四個(gè)新的潛在表觀遺傳標(biāo)記，與更高的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這些標(biāo)記在獨(dú)立隊(duì)列中得到了驗(yàn)證�？傮w而言，這項(xiàng)工作有助于提高對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌患者的表觀遺傳譜的理解，這可能是病因?qū)W的其他機(jī)制。進(jìn)一步研究表觀遺傳標(biāo)記有潛力增強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并促進(jìn)乳腺癌管理中的個(gè)性化方法。
圖7：與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的異常甲基化標(biāo)記模型。
參考文獻(xiàn)：
Ruiz-De La Cruz M,et al. Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria. NPJ Precis Oncol. 2024 Jun 19;8(1):136. pii: 10.1038/s41698-024-00611-z. doi: 10.1038/s41698-024-00611-z. PubMed PMID: 38898118.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
- 靶基因甲基化測(cè)序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
- ChIP等揭示糖皮質(zhì)激素和TET2共調(diào)控促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機(jī)制
- 游離細(xì)胞DNA（cfDNA）檢測(cè)整體研究方案及其應(yīng)用案例
- DNA甲基化修飾整體研究方案技術(shù)介紹及經(jīng)典案例分析
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