Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling

Keywords: Cancer-associated fibroblasts; Colorectal cancer; Fibroblast heterogeneity; NECTIN2; TinCAFs.

結(jié)直腸癌（CRC）是最常見和最致命的癌癥之一。CRC具有異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境，具有獨(dú)特的成纖維細(xì)胞群。腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的過程與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）有關(guān)。據(jù)報(bào)道，CAF調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的募集，并影響血管生成、腫瘤干性和耐藥性。因此，CAF在很大程度上促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展，被認(rèn)為是治療的重要靶點(diǎn)。

盡管在胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌和肺癌中對(duì)CAF的表征方面取得了進(jìn)展，但仍缺乏對(duì)結(jié)直腸癌CAF的全面分析。研究已經(jīng)報(bào)道了兩種主要的CAF亞型，它們要么表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分子和調(diào)節(jié)劑（稱為CAF-A），要么表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物（稱為CAF-B）。此外，CRC CAF特征與預(yù)后不良相關(guān)。然而，由于以往的研究主要集中在分析CRC的整體細(xì)胞組成上，因此對(duì)CAF亞型的廣泛分析受到測(cè)序CAF數(shù)量相對(duì)較少的阻礙。CAF在CRC中起著核心作用，目前仍缺乏對(duì)CAF異質(zhì)性的全面分析。

最近，在德國(guó)哥廷根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的一項(xiàng)研究中，通過結(jié)合單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA seq）和空間蛋白質(zhì)組學(xué)，對(duì)人類結(jié)腸和CRC組織樣本中的成纖維細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的亞型TinCAF，證明了 TinCAF 特征標(biāo)志物的高表達(dá)與 CRC 患者的無復(fù)發(fā)生存期縮短有關(guān)。這種新發(fā)現(xiàn)的CAF可能代表了未來CRC免疫療法的潛在靶點(diǎn)。研究成果發(fā)表在 Cancer Letters 期刊題為“Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling”。

首先，研究人員全面分析了成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，通過對(duì)8個(gè)不同樣本（6個(gè)CRC樣本，2個(gè)正常結(jié)腸樣本）進(jìn)行scRNA-seq（圖1 A、B），發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞聚集成了11個(gè)不同的簇（圖1 C）。有趣的是，大多數(shù)簇在正常樣本和CRC組織中都被發(fā)現(xiàn)（圖1 D），然而，簇3、5、7 和 9 幾乎只存在于 CRC 組織中，因此代表了 CAF 特異性簇。

基于對(duì)差異表達(dá)標(biāo)記基因的分析，已知的成纖維細(xì)胞亞型，如apCAF（簇1）、“上皮維持”成纖維細(xì)胞（簇2）、myCAF（簇3）和 iCAF（簇7）被鑒定出來（圖1 E）。簇9 顯示 MKI67、CENPF、CDK1 和其他細(xì)胞周期相關(guān)基因的高表達(dá)，表明該簇為增殖成纖維細(xì)胞的區(qū)室。簇5 不表達(dá)已知的 CAF 特征標(biāo)記物，但顯示出免疫相關(guān)基因的表達(dá)，如CD40、CD276和NECTIN2（圖1 E）。這證明了人類正常結(jié)腸組織和CRC組織中的成纖維細(xì)胞異質(zhì)性，揭示了已知的CAF亞型，但鑒定了一種新的CAF簇。

為了進(jìn)一步分析簇5 及其潛在的功能特征，利用基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)其中富集的基因集與干擾素反應(yīng)和氧化磷酸化相關(guān)，表明這些 CAF 具有免疫反應(yīng)和代謝活性（圖 1 F）。進(jìn)一步評(píng)估差異表達(dá)基因，注意到與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的其他基因，如 CD39、CD59、CAV1、MIF 和 Notch3（圖1 G）。這些數(shù)據(jù)說明，簇5 成纖維細(xì)胞與癌癥相關(guān)，但與已知的 CAF 亞群不同，并顯示出免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)譜。

當(dāng)比較同一患者CRC 成纖維細(xì)胞和正常組織中簇-特征標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)，證實(shí)了成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性和蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的 CAF 特異性特征。由于新發(fā)現(xiàn)的簇5 特別令人感興趣，研究人員更仔細(xì)地分析了簇5 蛋白標(biāo)記物NECTIN2（CD112）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NECTIN2表達(dá)僅在腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，主要與表達(dá)CD90的成纖維細(xì)胞亞群共定位，但不在上皮腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。

圖1 結(jié)直腸癌和結(jié)腸成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。

由于簇5 與免疫細(xì)胞和 T 細(xì)胞相互作用性狀相關(guān)，因此，實(shí)驗(yàn)接下來分析了 CAF 標(biāo)記蛋白與 T 細(xì)胞相關(guān)的表達(dá)模式。結(jié)果表明，所有CAF相關(guān)標(biāo)志物在接近T細(xì)胞的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)指出了T細(xì)胞和CAF之間的密切相互作用，并暗示了T細(xì)胞可能影響TME中某些CAF的募集和分布的可能性。

空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，CAF和腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞之間存在密切的相互作用。因此，使用共培養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)估了結(jié)直腸癌衍生的 CAF 對(duì) T 細(xì)胞的影響。首先，使用流式細(xì)胞術(shù)在不同患者的原代CAF培養(yǎng)物中檢測(cè)到簇5 CAF的6個(gè)特征蛋白標(biāo)記物（圖2 A、B），并證實(shí)了共表達(dá)（圖2 C），表明簇5 CAF的表型在原代培養(yǎng)物中得以維持。

然后將原代 CAF 與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)三天以表征 CAF 和 T 細(xì)胞之間的相互作用（圖2 D）。盡管在整個(gè)共培養(yǎng)過程中不斷刺激 T 細(xì)胞，但 CAF 顯著降低了 T 細(xì)胞活力和增殖，證明了 CRC CAF 對(duì) T 細(xì)胞的抑制特性（圖2 E）。CD4 輔助性T 細(xì)胞顯示 CD69 和 TIM-3 表達(dá)增加，其他測(cè)試標(biāo)志物沒有顯示出明顯的趨勢(shì)（圖2 F）。在 CD8 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞中，CD69 和 TIM-3 在 CAF 存在下也顯著上調(diào)。然而，CD25、CD137 和 PD-1 顯著下調(diào)（圖2 F）。這些數(shù)據(jù)表明，CAF可以在體外破壞T細(xì)胞的活化并抑制其增殖。

此外，分析了共培養(yǎng)后的 CAF 表型以評(píng)估直接 T 細(xì)胞相互作用引起的可能調(diào)節(jié)。值得注意的是，CAF 在共培養(yǎng)的三天內(nèi)顯著上調(diào)了 VCAM1 以及簇5 特異性 CAF 蛋白標(biāo)記物 NECTIN2 和 CD40（圖2 G），表明 T 細(xì)胞可以直接調(diào)節(jié) CAF 的表型，正如空間蛋白質(zhì)組學(xué)所揭示的那樣。CD40 是 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物 CD154（CD40L）的受體，而 NECTIN2 可以結(jié)合 T 細(xì)胞表達(dá)的多種受體，表明簇5 CAF 直接參與 CRC 中 T 細(xì)胞反應(yīng)的協(xié)調(diào)。

圖2 CAF-T細(xì)胞相互作用的功能分析。

實(shí)驗(yàn)假設(shè) CRC CAF 可以通過上調(diào)簇5 蛋白標(biāo)志物 NECTIN2 和 CD40 來抑制 T 細(xì)胞增殖和活化。為了研究這些標(biāo)記物的作用，在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了阻斷受體-配體結(jié)合的功能性抗體。在T細(xì)胞激活后，大多數(shù)T細(xì)胞獲得了效應(yīng)記憶或效應(yīng)記憶重新表達(dá) CD45RA 表型，而只有 20-30% 的 T 細(xì)胞表現(xiàn)出幼稚表型（圖3 A）。與CAF的直接相互作用顯著降低了T⁺ _EM 的豐度和 T_EMRA 細(xì)胞，而大約 60-80% 的 T 細(xì)胞保留在幼稚 T 細(xì)胞狀態(tài)。此外，在抗體介導(dǎo)的阻斷是NECTIN2而不是CD40時(shí)，CAF的抑制作用被完全消除。

對(duì)與CAF共培養(yǎng)的T細(xì)胞的活化和損耗標(biāo)志物表達(dá)的分析顯示出異常表型（圖3 B）：與單獨(dú)使用T細(xì)胞相比，活化和耗竭標(biāo)志物均增加。相比之下，CD40 和更明顯的NECTIN2阻斷顯著降低了 CD25、TIM-3、LAG3 和 PD1 的表達(dá)，表明這兩種 CAF 標(biāo)志物都是抑制作用所必需的。在CD8 T細(xì)胞中，NECTIN2阻斷的作用更為明顯，表明NECTIN2是CD8 T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。雖然阻斷NECTIN2對(duì)T細(xì)胞活化和分化有顯著影響，但NECTIN2受體的表達(dá)不受影響，這表明對(duì)T細(xì)胞的影響確實(shí)主要由NECTIN2介導(dǎo)。

最后，為了研究簇5 CAF特異性基因表達(dá)的臨床相關(guān)性，研究人員在1342例結(jié)腸癌患者的公開臨床數(shù)據(jù)庫(kù)中評(píng)估了NECTIN2、CD40和CD248的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NECTIN2高表達(dá)患者的預(yù)后明顯差于低NECTIN2表達(dá)的患者。同樣，CD40 或CD248的高表達(dá)也是該患者隊(duì)列中的不良預(yù)后因素。此外，NECTIN2、CD40 和 CD248 的高表達(dá)僅在 158 例微衛(wèi)星穩(wěn)定型（MSS）患者中與無復(fù)發(fā)生存期（RFS）的顯著降低相關(guān)，而在微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（MSI）高表達(dá)患者中不相關(guān)。

鑒于簇5 CAF 標(biāo)志物NECTIN2的顯著預(yù)后價(jià)值，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了其表達(dá)與其他腫瘤實(shí)體臨床結(jié)果的相關(guān)性，結(jié)果證實(shí)了在乳腺癌、肺腺癌、胃癌以及急性髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤中，高NECTIN2表達(dá)是患者預(yù)后不良的因素。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了NECTIN2作為免疫治療潛在靶點(diǎn)的臨床相關(guān)性和預(yù)后價(jià)值。

圖3 阻斷 CD40 或 NECTIN2 調(diào)節(jié)共培養(yǎng)后的 T 細(xì)胞表型和耗竭。

圖4 研究對(duì)人類結(jié)直腸癌和結(jié)直腸癌患者正常結(jié)腸組織中的成纖維細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行了全面分析，確定了11個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（圖4 a）。其中，發(fā)現(xiàn)了先前描述的亞群，例如myCAF-樣，iCAF-樣，apCAF-樣和“上皮維持”成纖維細(xì)胞。四個(gè)亞群幾乎只存在于 CRC 組織中，因此代表了 CRC CAF。研究鑒定了一種新的 CAF 亞群，基于其 T 細(xì)胞抑制和耗竭誘導(dǎo)特征，將其命名為 T 細(xì)胞抑制性 CAF（TinCAF）（圖4 b）。

綜上所述，該研究認(rèn)為這種新型NECTIN2-陽(yáng)性CAF亞型是抑制TME的重要參與者，也是下一代免疫檢查點(diǎn)抑制劑的潛在新靶點(diǎn)。這些抑制劑可能是一個(gè)有價(jià)值的選擇，特別是在MSS腫瘤中。

參考文獻(xiàn)：Agorku DJ, Bosio A, Alves F, Ströbel P, Hardt O. Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling. Cancer Lett. 2024 Jul 28;595:216985. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216985. Epub 2024 May 29. PMID: 38821255.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38821255/

Impact Factor 9.1

Online ISSN: 1872-7980

Print ISSN: 0304-3835

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