研究機(jī)構(gòu)：

美國加州斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院

文章背景及技術(shù)平臺：

輸卵管-卵巢高分化漿液性癌（HGSC）是一種常見且具有侵襲性的卵巢癌，通常在晚期被診斷，且易出現(xiàn)化療耐藥性，導(dǎo)致其5年生存率低于50%。盡管已有研究深入了解了HGSC的基因特征，但影響免疫募集和浸潤的分子和細(xì)胞機(jī)制仍不清楚。另外，現(xiàn)有免疫療法在治療HGSC方面的效果有限。本研究中，科研人員利用三個空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺收集空間數(shù)據(jù)，對94名患者的130個HGSC腫瘤進(jìn)行RNA空間原位檢測，生成了四個數(shù)據(jù)集來闡述腫瘤的特征和機(jī)制。

空間轉(zhuǎn)錄組測序平臺：

Discovery和Test數(shù)據(jù)集是使用CosMx SMI平臺生成，使用panel：CosMx Human 6K Discovery Panel、CosMx Universal Cell Characterization RNA 960-gene panel；

Validation 1數(shù)據(jù)集由10x Genomics Xenium平臺生成；

Validation 2 數(shù)據(jù)集由Vizgen平臺生成。

空間轉(zhuǎn)錄組測序平臺

HGSC腫瘤樣本信息

本研究收集和分析的數(shù)據(jù)集

 

01 主要結(jié)果

1. 生成HGSC單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組圖譜

利用SMI技術(shù)和組織芯片優(yōu)勢，從94例腫瘤的491,792個細(xì)胞中檢測了960個基因的表達(dá)水平，創(chuàng)建了一個單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜。通過對細(xì)胞類型進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)主要由惡性細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成。通過整合HGSC空間數(shù)據(jù)和六個公開可用的單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集，生成了一個統(tǒng)一的HGSC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，并進(jìn)行共嵌入分析，驗證了細(xì)胞類型的注釋和數(shù)據(jù)一致性。對數(shù)據(jù)的初步分析揭示了患者之間的異質(zhì)性腫瘤組織的細(xì)胞組成，惡性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞形成了空間上明顯不同的區(qū)室，這些區(qū)室與不同類型的免疫細(xì)胞（如T/NK細(xì)胞）的浸潤情況相關(guān)。T/NK細(xì)胞傾向于與特定的惡性細(xì)胞亞群共定位，較高T/NK細(xì)胞豐度的患者具有較高的生存率。

HGSC腫瘤的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示腫瘤微環(huán)境和免疫細(xì)胞浸潤模式

2. T細(xì)胞狀態(tài)反映了T細(xì)胞腫瘤浸潤狀態(tài)

使用無監(jiān)督方法對每種免疫細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行嵌入和聚類分析，發(fā)現(xiàn)位于惡性區(qū)室中的免疫細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上不同于位于其外部的免疫細(xì)胞。利用混合效應(yīng)模型（LMM）分析發(fā)現(xiàn)CD8 TIP的高表達(dá)與腫瘤浸潤狀態(tài)密切相關(guān)，特別是效應(yīng)性和耗竭性CD8+ T細(xì)胞傾向于在惡性細(xì)胞附近富集。隨后建立了一個以CD8+ T細(xì)胞為中心的配體-受體相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過分析惡性區(qū)室和基質(zhì)區(qū)室中不同細(xì)胞類型之間的配體-受體相互作用。在惡性區(qū)室中發(fā)現(xiàn)了CD80/CD86–CTLA4、TIM3–LAGLS9等抑制性配體-受體相互作用，這些相互作用可能抑制CD8+ T細(xì)胞的浸潤和殺傷能力。此外，CD8+ T細(xì)胞通過CXCR6–CXCL16和CXCR4–CXCL12的相互作用，在惡性或基質(zhì)區(qū)室中趨化性招募，這些信號調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞動態(tài)。

免疫細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)志著免疫細(xì)胞腫瘤浸潤狀態(tài)

3. 惡性細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)志并預(yù)測T/NK細(xì)胞浸潤

通過繪制惡性區(qū)室內(nèi)T/NK細(xì)胞的空間分布圖發(fā)現(xiàn)，在惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序（MTIL程序）中，高表達(dá)的基因可以標(biāo)記浸潤性TIL的存在。基因集富集分析發(fā)現(xiàn)MTIL程序與染色質(zhì)重塑、TGF-β反應(yīng)和干細(xì)胞分化相關(guān)。MTIL的空間分布表明MTIL表達(dá)在T/NK細(xì)胞豐度高的區(qū)域，并且MTIL表達(dá)的惡性細(xì)胞根據(jù)其周圍T/NK細(xì)胞的相對豐度進(jìn)行分層。ROC曲線分析表明MTIL可以在樣本、空間框架和單細(xì)胞水平上有效預(yù)測T/NK細(xì)胞的分布。這些結(jié)果有助于理解腫瘤免疫逃逸的分子機(jī)制。

惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序標(biāo)記并預(yù)測T/NK細(xì)胞豐度

4. MTIL預(yù)測患者存活率和ICB反應(yīng)

使用多變量Cox比例風(fēng)險模型分析HGSC患者的總生存率，將MTIL表達(dá)水平、T/NK細(xì)胞密度、患者年齡、疾病階段和其他臨床變量納入模型。分析表明，MTIL高表達(dá)與較差的總生存率顯著相關(guān)。Kaplan-Meier曲線顯示，MTIL高表達(dá)的患者總體生存率較低，表明MTIL可以作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。對黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌等不同癌癥類型的患者數(shù)據(jù)集進(jìn)行Kaplan-Meier曲線分析，評估MTIL表達(dá)水平對ICB治療進(jìn)展無進(jìn)展生存率（PFS）的預(yù)測效果，發(fā)現(xiàn)在這些癌癥類型中，MTIL高表達(dá)的患者在接受ICB治療后的PFS較差。在HER2陰性乳腺癌的I-SPY2臨床試驗數(shù)據(jù)集中，發(fā)現(xiàn)MTIL高表達(dá)顯著與pCR相關(guān)聯(lián)，這表明MTIL在不同腫瘤類型和治療條件下具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

MTIL表達(dá)預(yù)測ICB的臨床反應(yīng)

5. 腫瘤中MTIL表達(dá)和T/NK細(xì)胞豐度與CNAs（大量拷貝數(shù)改變）的關(guān)系

方差分析（ANOVA）發(fā)現(xiàn)MTIL的跨患者變異性大于腫瘤內(nèi)部變異性，即使在排除腫瘤微環(huán)境組成的影響后，MTIL的表達(dá)仍然是預(yù)測整個腫瘤組織核心的TIL水平的有效指標(biāo)。MTIL中正相關(guān)的基因包括干擾素受體（IFNGR2、IFNAR1、IFNAR2）以及干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）和RUNX1，負(fù)相關(guān)的基因包括TCF7L2、FGFR2和AXL。利用免疫測定發(fā)現(xiàn)BMP7在TIL缺乏的HGSC腫瘤中擴(kuò)增，抑制NK細(xì)胞中的IFN-γ和TNF分泌。配體-受體共定位分析發(fā)現(xiàn)MTIL的CXCL9、CXCL10、CXCL16、CCL5和CX3CL1化學(xué)因子的缺失與低TIL水平相關(guān)。通過CRISPR–dCas9在NK-92細(xì)胞中激活CXCR6，發(fā)現(xiàn)劑量依賴性和CXCR6依賴性NK細(xì)胞向CXCL16的定向遷移。

MTIL和T/NK細(xì)胞水平的遺傳關(guān)聯(lián)

6. MTIL程序?qū)Π┘?xì)胞免疫介導(dǎo)選擇壓力的功能影響

在單一培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞和兩種與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）共培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞中進(jìn)行了高含量CRISPR敲除（KO）篩選，發(fā)現(xiàn)MTIL-Up基因與免疫介導(dǎo)選擇壓力敏感性增加相關(guān)，而MTIL-Down基因與癌細(xì)胞對免疫介導(dǎo)壓力的敏感性降低相關(guān)，表現(xiàn)出脫敏效應(yīng)。Perturb-seq數(shù)據(jù)分析識別了43個正調(diào)控因子和104個負(fù)調(diào)控因子，正調(diào)控因子富集于端粒維持、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)代謝和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因。負(fù)調(diào)控因子富集于染色質(zhì)組織、Wnt通路、Myc靶基因和免疫抗性基因。

對Perturb-seq數(shù)據(jù)集的Meta分析確定了MTIL的調(diào)節(jié)因子

7. MTIL基因及調(diào)控因子的敲除對卵巢癌細(xì)胞免疫逃逸的影響

設(shè)計了74個MTIL基因和調(diào)節(jié)因子進(jìn)行高通量CRISPR敲除篩選，發(fā)現(xiàn)PTPN1和ACTR8敲除會激活MTIL程序，使惡性細(xì)胞對T細(xì)胞/NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性更敏感。IFNGR1、IRF1和STAT1敲除會抑制MTIL程序，使細(xì)胞對T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷具有抗性。MTIL阻遏物（ACTR8、DNMT1、FGFR1、PTPN1、MED12和MIF）的敲除放大了對NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而MTIL激活物（如STAT1、IFNGR1、INTS2、IRF1、PARP12等）的敲除抑制并抵消了對NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

高通量CRISPR敲除抑制MTIL的擾動

8．MTIL抑制因子PTPN1和ACTR8對卵巢癌細(xì)胞免疫殺傷的影響

生成PTPN1和ACTR8的敲除TYK-nu卵巢癌細(xì)胞系，PTPN1和ACTR8的敲除顯著增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞對NK細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性，但ACTR8的敲除并未影響卵巢癌細(xì)胞的生存能力。利用劑量控制的線性混合模型（LMM）分析使用ABBV-CLS-484（PTPN1/PTPN2抑制劑）處理的TYK-nu和OVCAR3細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ABBV-CLS-484對單獨(dú)培養(yǎng)中的細(xì)胞生存影響最小，但顯著增加了NK細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用。

抑制MTIL抑制因子使癌細(xì)胞對T/NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感

 

02 總結(jié) 

這項研究利用SMI等空間轉(zhuǎn)錄組平臺，結(jié)合組織芯片的優(yōu)勢，通過對大量樣本的檢測，全面繪制了HGSC腫瘤的空間圖譜，揭示了腫瘤組織和淋巴細(xì)胞浸潤的普遍規(guī)律。研究顯示，體細(xì)胞基因變異與惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失調(diào)和免疫逃逸之間存在密切聯(lián)系，這為破解HGSC的免疫逃逸機(jī)制提供了新視角。使用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和Perturb-seq數(shù)據(jù)，識別了潛在的細(xì)胞狀態(tài)調(diào)控因子。研究還發(fā)現(xiàn)，PTPN1和ACTR8的敲除顯著提高了卵巢癌細(xì)胞對T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性，同時PTPN1/PTPN2抑制劑ABBV-CLS-484也顯著增強(qiáng)了NK細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞的殺傷。研究結(jié)果為HGSC的免疫逃逸提供了新的診斷和干預(yù)策略，未來可以將PTPN1和ACTR8作為新的治療靶點，為免疫細(xì)胞工程和新型治療方法的設(shè)計提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。