圖1 mbd 5/6中FWA去阻遏僅限于發(fā)育中的花粉粒

作者進(jìn)一步研究和比較了幼苗、未開放花蕾和成熟花粉中的基因表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)成熟花粉中的上調(diào)差異基因數(shù)明顯高于幼苗和花蕾（圖2A）。統(tǒng)計(jì)不同組織中差異倍數(shù)的分布，發(fā)現(xiàn)花粉up-DEG在花蕾中也多上調(diào)表達(dá)，只是上調(diào)幅度較低（圖2B），在幼苗中不上調(diào)（圖2B）。而甲基化突變體metl中觀察到，約一半的花粉DEG在幼苗中也上調(diào)（圖2B），作者猜測(cè)一部分mbd 5/6花粉DEG在幼苗中被DNA甲基化抑制，且mbd 5/6損失不足以重新激活它們。

2. mbd 5/6突變體中，花粉中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本多是被CG甲基化抑制的基因或TE
分析花粉RNA-seq數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括mbd 5和mbd 6單突變體，三種不同的mbd 5/6雙突變體等多種突變體，分析結(jié)果顯示mbd 5/6靶標(biāo)大多是異染色質(zhì)基因座，且主要是由CG甲基化抑制。MBD5和MBD6廣泛調(diào)節(jié)被CG甲基化抑制的TE家族。作者還鑒定了一些與FWA相似的功能基因，具有啟動(dòng)子甲基化并被mbd 5/6和MET 1抑制。在研究的組織中，mbd 5/6和sln的轉(zhuǎn)錄表型在花粉中最強(qiáng)，并且MBD5/6靶標(biāo)是被CG甲基化抑制的基因和TE。
 

圖2 mbd 5/6轉(zhuǎn)錄去阻遏表型的組織特異性

3. snRNA-seq揭示了發(fā)育中的雄配子體細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄景觀
因花粉粒含有不同的細(xì)胞核類型，作者使用snRNA-seq來確定在花粉發(fā)育過程中哪些特定的細(xì)胞核發(fā)生了轉(zhuǎn)錄變化。單細(xì)胞結(jié)果中，作者鑒定到了小孢子核（MN）、精子核（SN）、營(yíng)養(yǎng)核（VN）、生殖核（GN）、和一些污染核（圖3C、D）。UMAP中，可以清晰看到VN的發(fā)育軌跡：從雙細(xì)胞階段到三細(xì)胞和成熟花粉（標(biāo)記為VN1至VN5）（圖3C）。此外作者還鑒定了GN1、GN2、MN1、MN2和MN3，并詳細(xì)分析了各個(gè)簇中的基因表達(dá)模式，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、小RNA機(jī)制的表達(dá)模式、組蛋白變體等。總的來說，該snRNA-seq數(shù)據(jù)集提供了擬南芥雄配子體發(fā)育過程中整體基因表達(dá)譜，是相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。
 

圖3 發(fā)育中的雄配子體的snRNA測(cè)序

4. MBD5/6靶標(biāo)在VN譜系中去阻遏
為研究花粉發(fā)育期間mbd 5/6去阻遏的細(xì)胞類型特異性，作者對(duì)ColO、mbd 5/6和sln突變體進(jìn)行snRNA-seq（圖4A）。發(fā)現(xiàn)mbd 5/6中，F(xiàn)WA基因在小孢子晚期表達(dá)增加，在雙細(xì)胞花粉的VN中達(dá)到峰值，在VN的雙細(xì)胞晚期開始降低（圖4B）。作者將mbd 5/6與每個(gè)簇的野生型進(jìn)行差異比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DEG在早期或晚期VN簇中上調(diào)（圖4C），這些基因的特征是啟動(dòng)子甲基化，其中包括幾個(gè)TE和新的注釋（圖4C和4E）。進(jìn)一步分析VN發(fā)育軌跡，發(fā)現(xiàn)這些DEG中，54個(gè)基因在早期VN中表達(dá)，然后沉默。83個(gè)DEG基因在晚期VN中上調(diào)（圖4F）。有趣的是，在野生型中也觀察到了同樣的模式，但幅度要低得多。表明去阻遏的階段特異性可能反映了所需發(fā)育階段特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)�？偟膩碚f，snRNA-seq數(shù)據(jù)揭示mbd 5/6和sln中沉默的喪失開始于小孢子晚期，并且在VN中沿著其發(fā)育軌跡逐漸變得更加突出，而GN和SN不受影響。
 

圖4 mbd 5/6中的轉(zhuǎn)錄去抑制僅限于MN/VN譜系

5. 其他沉默突變體在所有花粉核類型中都表現(xiàn)出廣泛的去阻遏作用
為探究參與甲基化DNA沉默的其他基因中的突變是否可能顯示出與mbd 5/6相似的模式，作者用一組具有TE去阻遏的突變體及對(duì)應(yīng)的野生型進(jìn)行了雄性配子體snRNA-se，并注釋到了對(duì)應(yīng)于花粉發(fā)育的最成熟階段（VN4、VN5、SN）的相對(duì)較少的細(xì)胞，這可能是由于metl植物中花發(fā)育的表型缺陷（圖5A）。

差異分析結(jié)果顯示，在met1、ddm1、mom1、morc等突變體，與mbd5/6和sln的DEG明顯不同，且各突變株的不同細(xì)胞類型中上調(diào)表達(dá)的基因也有不同。比較不同突變體的上調(diào)DEG發(fā)現(xiàn)，雖然大部分mbd 5/6靶標(biāo)在metl和ddm1中上調(diào)，但它們?cè)趍om1或morc中沒有上調(diào)（圖5F）。同樣，mom1和morc靶標(biāo)主要是met1和ddm1靶標(biāo)的子集，并且它們彼此很大程度上重疊，但在mbd 5/6中沒有上調(diào)（圖5F）。因此，作者猜測(cè)MBD5/6靶標(biāo)構(gòu)成了由DNA甲基化調(diào)控的基因座的獨(dú)特子集。
 

圖5 met1、ddm1、mom1和morc突變體在所有花粉細(xì)胞中表現(xiàn)出沉默缺失

6. 組蛋白H1的缺失揭示了mbd 5/6和sln在非生殖組織中的去阻遏表型
為探究VN細(xì)胞中的松弛染色質(zhì)狀態(tài)是否與mbd 5/6中沉默喪失的VN特異性有關(guān)，作者分析了包括從野生型GN、SN和成熟VN分離的細(xì)胞核進(jìn)行的轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序結(jié)果。作者觀察到，在野生型VN中，mbd 5/6靶標(biāo)處染色質(zhì)可及性明顯增加，并且在VN中失去更多的CG甲基化，這可能是因?yàn)閱��?dòng)子的開放性促進(jìn)DME的接近（圖6B）。然而，雖然VN中特定花粉育性基因的DME介導(dǎo)的去甲基化是非常廣泛的，導(dǎo)致這些基因高度表達(dá)并且不受mbd 5/6調(diào)節(jié)，但是mbd 5/6靶標(biāo)處的甲基化損失較溫和，并且僅導(dǎo)致野生型VN中非常低的表達(dá)水平（圖6B-E）。
 

圖6 mbd 5/6靶點(diǎn)的特征是野生型VN中的可及性增加

作者猜測(cè)，在mbd 5/6和sln幼苗中沒有可檢測(cè)到的TE去阻遏的原因可能是染色質(zhì)高度壓縮補(bǔ)償了甲基閱讀器的損失，并且足以維持基因沉默。為了驗(yàn)證這個(gè)想法，作者將mbd5/6和sln與h1.1/h1.2雙突變體（簡(jiǎn)稱h1，幼苗染色質(zhì)去致密化）雜交。RNA-seq結(jié)果顯示，mbd5/6或sln幼苗中不表達(dá)的FWA基因在h1中低表達(dá)，而在mbd5/6 h1和sln h1中明顯增強(qiáng)。此外，約有50個(gè)基因在mbd5/6和sln中表現(xiàn)出上調(diào)，而在mbd5/6 h1或sln h1中上調(diào)更加顯著。表明mbd 5/6和sln在更廣泛的組織中具有基因沉默功能，但其他沉默途徑阻止了VN以外的大多數(shù)細(xì)胞中靶基因的上調(diào)。
 

圖7 H1突變?cè)鰪?qiáng)了幼苗中mbd 5/6的去阻遏表型

參考文獻(xiàn)：
[1] Ichino L, Picard CL, Yun J, et al (2022) Single-nucleus RNA-seq reveals that MBD5, MBD6, and SILENZIO maintain silencing in the vegetative cell of developing pollen. Cell Rep 41:111699. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111699