親和柱技術(shù)應(yīng)用：紅曲產(chǎn)品中桔青霉素的檢測(cè)
關(guān)于紅曲
紅曲也叫紅曲紅、紅曲霉、紅曲米等，其作為一種天然發(fā)酵產(chǎn)物，其成分相對(duì)復(fù)雜，包括多種具有生物活性的物質(zhì)。其用糯米蒸制后接種紅曲菌種，發(fā)酵繁殖的，產(chǎn)品是發(fā)酵后的暗紅色糯米，經(jīng)粉碎后成為紅曲粉。它在食品工業(yè)中應(yīng)用十分廣泛，南方做燒肉或豆腐乳多使用。
同時(shí)，紅曲還具有降壓降脂、活血化瘀、健脾消食的功效。在保健品和藥品中也有廣泛應(yīng)用。
1、降壓降脂：紅曲可以降低血液黏稠度，提高血管舒張能力，恢復(fù)血管的彈性，降低血管的外周阻力，促進(jìn)血壓平穩(wěn)下降。而且紅曲中還含有他汀類(lèi)物質(zhì)，能降脂。所以紅曲具有調(diào)節(jié)血壓、降低血脂的功效。
2、活血化瘀：紅曲可以活血化瘀，主治產(chǎn)后惡露不盡、瘀滯腹痛、跌打損傷。
3、健脾消食：紅曲可以健脾消食，主治飲食停滯、胸膈滿(mǎn)悶、消化不良或赤白下痢。
紅曲的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：
根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》及其增補(bǔ)公告，紅曲米及紅曲紅作為著色劑可用于腐乳、碳酸飲料 、果凍、糕點(diǎn)、配制酒等多種食品中，其中風(fēng)味發(fā)酵乳中的最大使用量不得超過(guò)0.8 g/kg，糕點(diǎn)中的使用量不得超過(guò)0.9 g/kg，焙烤食品餡料及表面用掛漿不得超過(guò)1.0 g/kg，其他允許使用的食品則可根據(jù)生產(chǎn)需要適量使用。
另外鑒于紅曲中桔青霉素的危害，國(guó)家也設(shè)定了限量標(biāo)準(zhǔn)，GB 1886.181-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 紅曲紅》中規(guī)定紅曲紅中桔青霉素的限量為0.04 mg/kg。
桔青霉素親和柱簡(jiǎn)介
參考《GB/T 5009.222-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測(cè)定》，樣品經(jīng)提取液提取、過(guò)濾、稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)鍵合有桔青霉素特殊抗體的免疫親和柱。此時(shí)，桔青霉素被親和柱中的抗體特異性吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將桔青霉素從親和柱上洗脫下來(lái)。最后，用HPLC或液質(zhì)方法進(jìn)行定量檢測(cè)。桔青霉素親和柱規(guī)格：
柱容量：100ng/250ng
包裝：25支/盒，1ml，3ml
保存：2-8℃
保質(zhì)期：18個(gè)月
使用對(duì)象
本方法適用于紅曲制品、糧食、食品、飼料、調(diào)味品、藥材和酒類(lèi)等樣品中桔青霉素的測(cè)定
實(shí)驗(yàn)溶液制備
1) 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。2) pH7.0 PBS溶液：Clover pH7.0 PBS鹽包（貨號(hào)：C3001）：將鹽包用1000ml純水直接溶解，備用。保質(zhì)期18個(gè)月。
3) 0.1%吐溫 20-PBS 溶液:準(zhǔn)確移取 1mL 吐溫-20 以pH 7.0 PBS緩沖溶液定容至 1000mL。或10倍濃縮0.1%吐溫PBS緩沖液（貨號(hào)：G1112-C）直接稀釋10倍使用。
4) 0. 1% 磷酸溶液:準(zhǔn)確移取 1mL 磷酸加水定容至 1000mL。
5) 洗脫液 :甲醇-0. 1% 磷酸溶液( 70+30 ) 取70mL甲醇加30mL0. 1% 磷酸溶液( 70+30 )，混合均勻。
樣品前處理：
1、紅曲及其制品：
稱(chēng)取5g磨細(xì)的樣品，置于250mL錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入100mL甲醇/水（7+3）溶液。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min。將提取物到入槽紋濾紙或普通濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取1mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用39 mL pH 7.0 PBS溶液：稀釋?zhuān)靹�。將上步稀釋液通過(guò)玻璃微纖維過(guò)濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。2、大米，玉米，辣椒等
稱(chēng)取10g磨細(xì)的樣品，置于150mL錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入50mL甲醇/水（7+3）溶液。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min。將提取物倒入槽紋濾紙或普通濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取1mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用49 mL pH 7.0 PBS溶液：稀釋?zhuān)靹�。將上步稀釋液通過(guò)玻璃微纖維過(guò)濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。
親和柱凈化程序：
將上步10 mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入到親和柱中。用10 mL pH 7.0 PBS溶液或0.1%吐溫 20-PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗親和柱。用1mL 洗脫液（甲醇-0. 1% 磷酸溶液70+30）以1 滴/秒的流速淋洗親和柱，將所有樣品洗脫液收集于玻璃測(cè)試管中，混勻，注入HPLC檢測(cè)。
液相色譜條件：
色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）
流速：0.8mL/min
檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)350nm,發(fā)射波長(zhǎng)500nm;
進(jìn)樣體積：20~100uL
流動(dòng)相1：0.1%磷酸:乙腈=35:65(V/V)
流動(dòng)相2：流動(dòng)相 A 液:乙腈，流動(dòng)相 B 液:0. 1% 磷酸。
流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表
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時(shí)間 /min |
乙腈 / % |
0. 1% 磷酸 / % |
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0 |
40 |
60 |
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1 |
40 |
60 |
|
7 |
90 |
10 |
|
9 |
90 |
10 |
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10 |
40 |
60 |
|
15 |
40 |
60 |
實(shí)驗(yàn)圖譜及數(shù)據(jù)：
高效液相色譜儀桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（50ppb)譜圖如下：
紅曲粉樣品加標(biāo)(2000ppb)譜圖如下：
添加回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
|
紅曲粉樣品1 |
紅曲粉樣品2 |
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|
本底（ppb） |
0.00 |
845 |
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加標(biāo)2000ppb |
2026 |
2820 |
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回收率 |
101% |
99% |
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檢測(cè)桔青霉素產(chǎn)品配置清單：
| 編號(hào) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) |
| 1 | IAC109 | CLOVER桔青霉素親和柱（配套鹽包PBS緩沖液），3ml/1ml，25支/盒 |
| 2 | ZJ0612 | CLOVER多位泵流操作架, 包括以下部件：1、一個(gè)12位操作架。 2、一個(gè)空氣泵。3、6個(gè)10ml玻璃注射器。4、連接頭和塑料軟管各6個(gè)。 |
| 3 | CNtest9042 | CNtest桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，100ug/ml，1ml/瓶 |
| 4 | C546150-U | HPLC Column：Cloversil Myco-C18, 真菌毒素色譜柱，5μm, 4.6×150mm |
| 5 | C546250-U | HPLC Column：Cloversil Myco-C18, 真菌毒素色譜柱，5μm, 4.6×250mm |
| 6 | 36020C | Filter Funnel, 65mm塑料漏斗，10 個(gè)/包 |
| 7 | 36010 | CLOVER一次性塑料燒杯，25個(gè)/包 |
| 8 | 31240C | CLOVER折疊槽紋濾紙，100張/盒 |
| 9 | 31955C | CLOVER玻璃微纖微濾紙，100張/盒 |
| 10 | 34000C | CLOVER一次性測(cè)試管，250支/盒 |
| 11 | 20202 | 帶1.1升不銹鋼均質(zhì)杯的均質(zhì)器，220V，可定時(shí) |
| 12 | YQ-CL200 | CLOVER 多管渦旋混勻儀（500-2500轉(zhuǎn)/分鐘） |
| 13 | CL-BC9002 | 9-425進(jìn)樣瓶蓋包含蓋墊，一字開(kāi)口，100個(gè)/包 |
| 14 | CL-SB9002 | 9-425透明進(jìn)樣瓶，帶刻度，2ml，100只/盒 |
| 15 | CL-SB9004 | 9-425棕色進(jìn)樣瓶，帶刻度，2ml，100只/盒 |
| 16 | CN13N22 | CLOVER有機(jī)系針式過(guò)濾器φ13, 0.22um，100個(gè)/桶 |
| 17 | CN13M22 | CLOVER水系針式過(guò)濾器 φ13，0.22um，100個(gè)/桶 |
