01 研究背景

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在癌癥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越重要。傳統(tǒng)的癌癥分類方法主要依賴于臨床和病理參數(shù)，其中包括一系列標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物。然而，這種傳統(tǒng)方法無法全面揭示腫瘤發(fā)展的復(fù)雜分子動(dòng)態(tài)。目前腫瘤分子分型方法研究較多從基因組數(shù)據(jù)出發(fā)，轉(zhuǎn)向基于基因表達(dá)譜的分類方法。這種轉(zhuǎn)變使得我們不再僅僅依賴于組織學(xué)特征進(jìn)行癌癥分類，而是更加注重腫瘤的分子特征和基因改變。在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中，腫瘤分子分型的研究在臨床實(shí)踐中對(duì)患者的個(gè)性化管理中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。盡管在腫瘤分子分型方面取得了很多研究進(jìn)展，但該領(lǐng)域仍面臨著重要挑戰(zhàn)，其中最重要的是缺乏對(duì)現(xiàn)有腫瘤分型方法的全面比較評(píng)估。此外，雖然各分型方法有其優(yōu)勢(shì)，但尚未實(shí)現(xiàn)將這些不同方法整合起來以發(fā)揮它們的共同優(yōu)勢(shì)。這個(gè)空白突顯了對(duì)當(dāng)前分型技術(shù)進(jìn)行臨床定量評(píng)估比較的緊迫性，需要開發(fā)出一個(gè)平臺(tái)，以比較不同方法在不同臨床場(chǎng)景下的優(yōu)劣，并且進(jìn)行優(yōu)化整合這些他們的優(yōu)勢(shì)。

02 研究思路

Themis利用了38個(gè)來源于癌癥基因組圖譜（TCGA）和已有研究的測(cè)試數(shù)據(jù)集（如GEO），并集成了多種現(xiàn)有研究的腫瘤分型方法，包括基于特征基因（如Stemness、Anoikis、Metabolism）、基于腫瘤微環(huán)境細(xì)胞組成特征和基于通路的分型方法。通過將已有分型方法應(yīng)用于多個(gè)測(cè)試數(shù)據(jù)集并進(jìn)行定量分析，Themis對(duì)每種方法的穩(wěn)健性進(jìn)行了嚴(yán)格評(píng)估。通過比較生存預(yù)后（總生存期（OS）、無進(jìn)展生存期（PFS））、免疫浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)（ESTIMATEScore、ImmuneScore和StromalScore）和治療預(yù)測(cè)（免疫檢查點(diǎn)阻斷，ICB）等指標(biāo)，Themis能夠揭示不同分型方法的相對(duì)優(yōu)勢(shì)和局限性。如圖1所示。

圖1. Themis流程

03  研究結(jié)果

1、綜合評(píng)價(jià)多種腫瘤分子分型方法：Themis框架

我們首先整合了8種已有研究的方法Stemness、Anoikis、Metabolism、TME1(Cibersort)、TME2(MCPcounter)和三種基于通路的分型方法Immune-Cancer Pathway、Immune Status Pathway和Cancer Pathway，分別通過使用不同的R包ConsensusClusterPlus、NMF、hclust進(jìn)行聚類分析。隨后圍繞上述聚類的分型結(jié)果進(jìn)行定量分析，以探索分子分型結(jié)果與各種臨床表型之間的相關(guān)性，包括總生存期（OS）、無進(jìn)展生存期（PFS）、信使核糖核酸干細(xì)胞指數(shù)（mRNAsi）、免疫浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)（ESTIMATEScore、ImmuneScore和StromalScore），以及TIDE算法預(yù)測(cè)的免疫治療反應(yīng)（免疫檢查點(diǎn)阻斷，ICB）和pRRophentic R包預(yù)測(cè)的化療藥物反應(yīng)。

圖2. 測(cè)試數(shù)據(jù)結(jié)果。（A）穩(wěn)健性方面的表現(xiàn)（紅色）包括K-M分析（OS/PFS，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）、單變量Cox分析（OS/PFS，Wald檢驗(yàn)）、mRNAsi評(píng)分、免疫浸潤(rùn)評(píng)分和TIDE免疫療法（ICB）的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（ANOVA檢驗(yàn)）。（B） 穩(wěn)健性（紅色）方面的表現(xiàn)包括化療藥物的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（ANOVA檢驗(yàn)）。不同分類患者組的定量結(jié)果比較的p值為表的內(nèi)容。對(duì)負(fù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的p值（-Log10（p.value））進(jìn)行記錄，并使用氣泡圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。列出了每個(gè)數(shù)據(jù)集的相應(yīng)色塊、每個(gè)定量方法的相應(yīng)序號(hào)以及總體性能（彩色梯度）。對(duì)于所有彩色點(diǎn)，陰影越深表示性能越好，灰色點(diǎn)表示p>0.05，即結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。如果為空白且沒有點(diǎn)，則意味著沒有相應(yīng)的臨床信息可用于該數(shù)據(jù)集的定量計(jì)算。

2、Themis在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用

為評(píng)估已建立的分型方法的實(shí)用性，我們?cè)赥CGA的30種不同腫瘤類型的數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了系統(tǒng)應(yīng)用。這項(xiàng)分析旨在辨別這些方法在各種癌癥中的適應(yīng)性和相關(guān)性，重點(diǎn)關(guān)注分子異質(zhì)性和臨床表型相關(guān)性。氣泡圖中總結(jié)的結(jié)果（圖3A）強(qiáng)調(diào)，適當(dāng)分型方法的選擇在很大程度上取決于固有的腫瘤異質(zhì)性和臨床表型的相關(guān)性（圖3）。

例如，在TCGA腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）數(shù)據(jù)集中，發(fā)現(xiàn)Stemness、Anoikis、Metabolism、TME2和Cancer Pathway等分型方法可以預(yù)測(cè)生存結(jié)果（①-⑥），其中大多數(shù)方法產(chǎn)生了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后定量結(jié)果。對(duì)于與腫瘤mRNAsi和微環(huán)境相關(guān)的評(píng)分(⑦-⑩)，Stemness、Anoikis、Metabolism、TME2和Immune Status Pathway等分型方法顯示出與這些因素的顯著相關(guān)性。然而在TIDE免疫治療（⑪）結(jié)果方面，只有Anoikis和TME2提供了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)測(cè)。對(duì)這些因素的綜合分析表明，ACC腫瘤樣本可能受益于使用Anoikis和TME2分型方法（圖3A）。這種綜合分析表明可以根據(jù)特定的臨床和分子標(biāo)準(zhǔn)，為不同的腫瘤類型量身定制分型方法。此外，我們舉例說明了如何使用雷達(dá)圖來比較ACC數(shù)據(jù)集上分型方法的性能。K-M分析（OS①/PFS②）表明Anoikis法在ACC中最具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OS③和PFS⑤的單變量cox分析顯示，Cancer Pathway方法在ACC中顯著（圖3B）。這些分型方法的綜合性能，以包括所有評(píng)估維度的雷達(dá)圖面積為代表，將Stemness、Metabolism和TME2定位為ACC的主要方法（圖3C）。

3、Themis在個(gè)性化的分型方法設(shè)計(jì)中的應(yīng)用

Themis可以進(jìn)一步優(yōu)化分型方法。例如，通過結(jié)合ACC、Stemness和Metabolism中表現(xiàn)最好的方法，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的分型策略，稱為“Stemness-Metabolism”（圖3D）。隨后與其他方法比較分析顯示，“Stemness-Metabolism”方法在多個(gè)定量指標(biāo)上都有顯著的增強(qiáng)（圖3E）。此外，通過計(jì)算雷達(dá)圖下的總面積，“Stemness-Metabolism”方法總體的分子分型效果超過了Stemness和Metabolisms方法（圖3F-3G）。我們方法的優(yōu)化結(jié)果并非偶然，因?yàn)橥ㄟ^隨機(jī)組合的方法無法獲得優(yōu)化的結(jié)果。當(dāng)結(jié)合兩種性能較差的方法時(shí)，Anoikis和TME1（稱為Anoikis-TME1）；以及性能良好的方法Stemness和性能較差的方法TME1（稱為Stemness-TME1），獲得了較差的結(jié)果（圖3E-3G）。這些結(jié)果證明了Themis在指導(dǎo)個(gè)性化治療方案的分型方法設(shè)計(jì)方面的潛力。

圖3. Themis用于泛腫瘤分子分型研究。（A）根據(jù)泛癌癥可用性（綠色）對(duì)其性能進(jìn)行了可視化。對(duì)于所有彩色點(diǎn)，陰影越深表示性能越好，灰色點(diǎn)表示p>0.05。（B） 雷達(dá)圖顯示了使用所有方法可視化的ACC數(shù)據(jù)集與臨床表型相關(guān)的定量結(jié)果。（C）條形圖顯示了ACC數(shù)據(jù)集中方法定量結(jié)果的雷達(dá)繪圖區(qū)域的定量比較。（D）使用兩種分型方法（Stemness和Metabolism）的組合優(yōu)化結(jié)果（將高干性和低干性與高代謝和低代謝特征相結(jié)合）。（E）氣泡圖顯示了“Stemness-Metabolism”方法與其他方法之間的性能比較分析。（F）雷達(dá)圖顯示了在相同數(shù)據(jù)（ACC）中使用這些不同的分型方法與臨床表型相關(guān)的定量結(jié)果。（G）條形圖顯示了ACC數(shù)據(jù)集中“Stemness-Metabolism”方法和其他方法的定量結(jié)果之間的雷達(dá)繪圖區(qū)域的定量比較。

Themis同樣可以應(yīng)用于某種新的生物學(xué)特征相關(guān)的分子分型方法的評(píng)估（圖4）。使用Themis評(píng)估比較上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)特征的方法，我們可以系統(tǒng)地評(píng)估與該分型方法結(jié)果有關(guān)聯(lián)的臨床表型相關(guān)性，進(jìn)而推斷出該特征相關(guān)方法在特定腫瘤類型或臨床場(chǎng)景下的作用。

基于不同分類算法的EMT（Consensus）和EMT（NMF）方法的結(jié)果顯示，二者在大多數(shù)癌癥類型中具有很高的一致性（圖4A）。將這兩種EMT相關(guān)的亞型分類方法與八種現(xiàn)有的分子亞型分類方法進(jìn)行比較，雷達(dá)圖結(jié)果和雷達(dá)圖面積計(jì)算（圖4B）顯示，考慮到多個(gè)臨床相關(guān)的表型，如綜合生存預(yù)后、腫瘤免疫浸潤(rùn)得分、干細(xì)胞狀態(tài)和免疫治療預(yù)測(cè)，EMT的亞型分類方法在ACC、BLCA、COAD、GBM、LGG、LUSC、OVCA、PRAD、STAD和UCEC中表現(xiàn)最佳（圖4B）。這意味著EMT可能在這些癌癥中發(fā)揮重要作用，并且對(duì)EMT相關(guān)進(jìn)展的研究對(duì)于理解腫瘤的生物特性和預(yù)后可能非常重要。

圖4. Themis比較了EMT特征在不同腫瘤的分子分型中的應(yīng)用。

4、Themis指導(dǎo)個(gè)性化醫(yī)療策略

Themis能夠選擇適合特定數(shù)據(jù)集的最佳分型方法，并有助于對(duì)用戶的分子分型方法進(jìn)行性能評(píng)估。我們使用Themis，將一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌分型方法（Denise et al）研究與已有方法進(jìn)行比較，以確定其是否適用于特定數(shù)據(jù)集。比較腫瘤分型在與患者藥物反應(yīng)（patient drug responses，pCR）相關(guān)的分析中的應(yīng)用，對(duì)不同患者亞型的治療效果進(jìn)行量化分析。除了上述藥物反應(yīng)指標(biāo)外，還利用免疫浸潤(rùn)評(píng)分和TIDE免疫療法預(yù)測(cè)作為定量指標(biāo)。隨后，應(yīng)用平臺(tái)現(xiàn)有的分型方法對(duì)Denise等人的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分子分類。可視化了每種方法的定量結(jié)果的p值。

對(duì)于全部組藥物治療（All arm），所有方法的結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都是顯著的（p <0.05，ANOVA檢驗(yàn)）。三種最顯著p值的方法是Denise et al，Immune-Cancer Pathway和Stemness研究方法（圖5A）。雷達(dá)圖結(jié)果顯示了綜合表現(xiàn)最好的三種亞型方法分別是Denise et al，Immune-Cancer Pathway和Stemness（圖5B、5C）。此外，我們呈現(xiàn)了不同分型方法在每種藥物預(yù)測(cè)指標(biāo)中的統(tǒng)計(jì)顯著性排名（圖5D）。研究結(jié)果體現(xiàn)了Denise等人的方法在全部組藥物（All arm）治療中的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于特定的AMG386藥物治療的患者分類策略，Immune-Cancer Pathway方法成為最合適的選擇，說明了用戶可以根據(jù)其個(gè)性化醫(yī)療策略的需求選擇患者的分子分型方法（圖5D）。

圖5. Denise et al方法的Themis應(yīng)用示例數(shù)據(jù)。

奚悅為本文唯一第一作者，論文的通訊作者為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院郝潔研究員，上海生物芯片鄒欣研究員，山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院張意茗主任。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（82170045，31800253），上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院高水平地方高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) (SSMU-ZLCX20180502)的支持。